基于质谱蛋白质鉴定，第1节：蛋白质鉴定技术简介

　 基于质谱的蛋白质鉴定，第 1 节：蛋白质鉴定技术简介

　蛋白质组学（Proteomics）的分析一般可分为四类分析方法：（i）快速而简单的分析方法，用于从复杂混合物中纯化少量蛋白质；（ii）快速而灵敏的方法，可从目标蛋白质中获取少量但足够的结构信息 （iii）获取拓展的蛋白质或 DNA 序列数据库，以及（iv）能够通过计算机算法将DNA 序列信息与各种类型的蛋白质结构信息结合起来，例如 N 末端蛋白质或内部肽序列，氨基酸组成，肽质量指纹图，MS 片段图谱或所选肽的序列标签。

　高分辨率凝胶电泳（2-D 凝胶电泳是目前最有效的蛋白质分离方法），自 70 年代后期就已经被用作分析工具。但一直到蛋白质样品制备方法和测序工具得到了相当大的改进之后，二维凝胶电泳才发展成为制备性的蛋白质纯化程序。蛋白质能够通过电印迹法转到化学惰性的膜上，可能是蛋白质微量样品制备中最重要的步骤之一，因为它将高分辨率凝胶电泳（纯化步骤）和气体色谱（分析步骤）直接联系在了一起。电印迹法又可以结合基于膜的埃德曼化学法形成 N 末端或内部肽序列。这种组合技术现在通常称为微测序，因为与早期技术相比，它使样品制备的灵敏度提高了至少 100 倍，从而可以分析低至 pmole 或 μg 级别的蛋白质。这项技术在 80 年代后期开始流行，当时聚二氟乙烯（PVDF）印迹膜已经成功商业化。同一时期，第一个 2-D 凝胶蛋白序列数据库（实际蛋白质组学的祖先）也诞生了。但是，由于当时已知的蛋白质或 DNA序列数量很少，这些数据库中的信息非常有限。因此，微测序法更常被用作 cDNA 克隆的起始点，而不是用于通过同源性进行蛋白质鉴定。

　随着蛋白质，DNA 和表达序列标签（EST）等数据库信息在 90 年代以来的迅速增长。从头测序变得不再那么常见，而重测序或通过比较法进行测序变得更加重要。这是生物质谱（MS）技术进入测序领域的正确时机。质谱 MS 是非常快速灵敏的技术方法，即使到了现在，MS 技术的分析速度和灵敏度仍未达到其极限。MS 技术的两大主要领域是：基质辅助激光解吸电离/飞行时间（MALDI-TOF）质谱和电喷雾电离（ESI）质谱，这两种方法的区别在于其电离分析物的方法，相关的样品制备程序也不同。因此 ESI 主要与液相色谱仪器相结合，而 MALDI-TOF更适合于高通量检测，更适合于大规模的蛋白质组学分析。随着快速蛋白质鉴定技术的发展，对高度可重复的，可比较的，大规模二维凝胶电泳方法的需求稳步增长，也通过引入可固定的pH 梯度法得以实现。

　最后，还需要将所有的数据结合起来。氨基酸序列，肽质量指纹或肽 MS 片段数据需要被翻译为带注释或无注释基因组序列数据库中的 DNA 序列。每个 DNA 序列可以从两端和三个不同的开放阅读框进行读取。在某些表达序列标签（EST）中，经常会出现错误，使得搜索变得困难。而计算机算法可以成功地解决遇到的这些挑战，可以匹配到最接近 MS 分析获取的结构信息对应的蛋白质或 DNA 序列片段。

　基于质谱的蛋白质鉴定系列总结，将主要集中在两个部分：（i）如何从凝胶纯化的蛋白质样品中获得必要的结构信息，（ii）以及如何使用此类信息鉴定蛋白质。第 2 节简要介绍了基于常规Edman 的 N 末端或内部肽测序的方法。

　在第二部分中，我们重点介绍基于 MALDI-TOF 的蛋白质分析方法，并简要回顾将 MS 生成的数据与数据库中存储的序列进行匹配的算法。

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　北京百泰派克公司采用高分辨率质谱平台技术，包括 Thermo Fisher 的 Q Exactive 质谱仪，LTQ Orbitrap Velos 质谱仪，以及 AB SCIEX 的 6500 Q TRAP 质谱仪，结合 Nano-LC 高通量液相色谱技术，能够对 SDS-PAGE 蛋白条带、2D 蛋白胶点等样品中的蛋白质进行高效精准鉴定。胶条、胶点蛋白质谱鉴定服务可保证 100%的鉴定率，否则不收任何费用。

　文献参考：Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis, 2000.

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