不同基因型变异链球菌临床分离株的分离和鉴定

[摘要] 目的 分离鉴定变异链球菌临床分离株。方法 收集高龋患者和无龋健康人口腔中牙菌斑标本进行厌氧培养，通过细菌形态学观察、生物化学鉴定、自动微生物分析系统分析、聚合酶链反应（PCR）扩增变异链球菌基因的特异性片段表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（spaP）、葡糖基转移酶B（gtfB）和葡聚糖酶（dexA）以及基因分型等方法对获得的变异链球菌临床分离株进行鉴定。结果 从32例临床受试者口腔中分离获得46株变异链球菌临床分离株，经生物化学，自动微生物分析系统，变异链球菌的特异性基因spaP、gtfB和dexA的PCR扩增均鉴定为变异链球菌，基因分型发现其中5株临床分离株的基因型与其他菌株相同。结论 获得41株不同基因型变异链球菌临床分离株。

[关键词] 变异链球菌； 基因型； 分离； 鉴定

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.020 变异链球菌（Streptococcus mutans）是人类口腔中最主要的致龋菌[1]。变异链球菌群中各菌种的分离与

鉴定是进行龋病研究的基础。细菌菌种的鉴定方式经历了由传统的表型、血清型方法到以分子生物学为基础的基因型方法的转变。本文采用形态学、生物化学、自动微生物分析系统、扩增变异链球菌基因的特异性片段区域以及基因分型等方法对获得的变异链球菌临床分离株进行鉴定，为龋病临床和基础研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

变异链球菌国际参考株Ingbritt（首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所提供），金黄色葡萄球菌临床分离株188号（军事医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学研究室提供）。

1.2 病例选择

纳入标准：高龋患者，龋失补牙（decayed-mis-sing-filled-tooth，DMFT）指数≥6；无龋健康人，

DMFT指数=0。排除标准：饮食结构异常，有嗜甜

食（饮）及睡前进餐等不良饮食习惯者；接受放疗和化疗的患者；舍格伦综合征患者；严重全身系统性疾病者；近3个月内服用抗生素者；接受正畸治疗者；口腔卫生状况不良者；牙齿结构异常者；涉及取样的牙体有牙髓病变、根面暴露或根面龋、未控制的牙周病变、冠或固定桥等修复体者。

根据纳入及排除标准，从临床初次就诊的患者中选取受试者，受试者的取样位点均为无龋损的釉质光滑面。采集菌斑前，均向受试者及其陪同人员说明实验目的和过程，取得同意并签署知情同意书。

40例受试者参加实验，其中高龋患者26例（DMFT指数为7.40±2.07），无龋健康人14例。

1.3 菌斑采集与处理

受试者清水漱口，去除食物残渣，棉卷隔湿并用无菌生理盐水冲洗收集区，更换棉卷，隔湿，用无菌刮匙刮取釉质光滑面菌斑后，立即将其置于预先消毒灭菌，盛有1 mL改良液体Cary-Blair运送培养基，上覆液体石蜡的Eppendorf管中密封。标本在2 h内转送至实验室。所取的菌斑样本经振荡器混匀1 min后，用无菌生理盐水做10倍系列稀释。

1.4 变异链球菌的分离

1.4.1 细菌初代培养 取原液、10-1、10-2、10-3稀释液各100 μL，接种于胰蛋白酶水解物-酵母提取物-半胱氨酸-蔗糖-杆菌肽琼脂（tryptone-yeast extract-cysteine with sucrose and bacitracin agar，TYCSB）培养平板[2]内，置于厌氧环境（体积分数80%N2、10%H2、10%CO2）下37 ℃培养48 h，然后进行菌落形态的观察。

1.4.2 细菌次代纯化培养 将经初代培养的具有典型菌落形态的单个菌落接种于轻型唾液链球菌-杆菌肽琼脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）

培养平板[2]内，置于厌氧环境下37 ℃培养48 h，然后

进行菌落形态的观察及革兰染色检查。

1.5 变异链球菌临床分离株的鉴定

1.5.1 形态学鉴定 纯化培养的细菌经革兰染色，于油镜（100×10）下观察菌体染色、形状和排列情况。

1.5.2 生化鉴定 用无菌接种环收集培养48 h的MSB培养平板表面的菌落（经镜下观察证实为纯化培养

物），混悬于1.0 mL的无菌生理盐水中制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液。取待测细菌悬液分别滴入需要实验的盛有甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖、七叶苷和精氨酸的安瓿瓶中，每瓶3滴，以进行临床分离株的糖酵解实验和水解实验，经37 ℃培养24 h后观察结果。此外，将菌悬液滴加于清洁的载玻片上后，滴加体积分数3%过氧化氢，观察有无气泡产生。以变异链球菌国际参考株Ingbritt为阳性对照，无菌生理盐水为阴性对照。

1.5.3 自动微生物分析系统鉴定 经传统生化鉴定确定为变异链球菌的临床分离株，再分别用API 20 Strep鉴定条或VITEK 2全自动微生物分析仪进一步鉴定，以确保结果的准确性。实验方法参照仪器使用说明书进行。API 20 Strep的结果分别于4 h和24 h读取；VITEK 2全自动微生物分析仪的测定结果于8 h内读取。经上述鉴定方法证实为变异链球菌者，用体积比1∶1的甘油脑心浸液（brain-heart infusion，BHI）液体培养基保种，于-70 ℃冻存备用。

1.5.4 分子生物学鉴定 通过聚合酶链式反应（poly-

merase chain reaction，PCR）方法扩增变异链球菌基因的特异性片段区域，包括表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（sur-face protein antigen Ⅰ/Ⅱ，spaP）基因[3]、葡糖基转移酶B（glucosyltransferase B，gtfB）基因[4]和葡聚糖酶（dextranase，dexA）基因[5]，目的片段大小分别为192、517和1 272 bp。以变异链球菌国际参考株Ingbritt为阳性对照，金黄色葡萄球菌临床分离株188号为阴性对照。

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