面粉中毒麦成分检测方法研究进展

摘要:从分子技术和化学技术两方面综述了近年来面粉中毒麦成分的一些相关检测方法,包括毒麦及其近似种的分型研究等,同时也阐述了相关检测方法的应用与理论依据。

关键词:面粉;毒麦成分;检测

中图分类号:S211.7文献标识码:A DOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.03.044

Research Advances on the Detection of Lolium Content in Flour

LIU Wang1,KANG Lin2, GAO Bi-da1,CHEN Dong-mei 2

(1.Bio-safe Science and Technology Collage,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China;2.Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen 518010,China)

Abstract:Some related detection methods on the Lolium temulentum in flour were summarized during recent years from the aspects of molecule technology and chemistry technology, such as genotype analysis of Lolium and its similar species. Meanwhile, the applications of related detection methods and the basis theory werealso elaborated.

Key words: flour;Lolium temulentum;detection

面粉作为人类的主要食物来源有着举足轻重的地位。据最新统计:2008年1—10月累计进口小麦373万t。资料显示,中国进口小麦主要来自美国、澳大利亚、德国、法国、阿根廷及东北亚、中亚和独联体等国家,这些国家均是毒麦的主要分布区。

中国在进口粮谷类产品中经常截获毒麦:如1989年南京、青岛、广州等14个出入境检验检疫局分别从美国、法国等11国的进口粮谷类产品中截获21批次毒麦;2004年深圳局从旅客携带物中截获3批次毒麦。

毒麦种子含有毒麦碱(Temuline-C7H12N2O),能麻痹动物中枢神经,人吃了含4%毒麦成分的面粉就会引起中毒反应,家禽食入剂量为体重0.7%的毒麦时就会中毒。据不完全统计,1983年中国因食用毒麦或含毒麦成分的面粉制品而中毒的人数多达1 200多人。据有关部门统计,2000年中国为清除毒麦所花经费至少达2亿元人民币[1-5]。

对于面粉中毒麦成分含量的检测未见有相关报道。但目前,各种检测技术已非常成熟,而且已广泛应用于各个领域,可以借鉴其方法对面粉中的毒麦成分进行检测。

1分子技术在毒麦检测及相关方面的应用研究

1.1SNP技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA 序列多态性,而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1%。它包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式[6]。

SNP技术作为一类遗传标记在遗传学分析中得以广泛应用。SNP 具有很高的遗传稳定性,并且此标记在人群中只有两种等位型,无需对片段长度做出测量,所以SNP检测分析方法易实现自动化[7]。SNP作为“第二代DNA遗传标记”可应用于构建高密度遗传连锁图谱,进行致病基因以及人类起源迁移进化的研究,也可以应用于家畜遗传育种以及遗传图谱和物理图谱的整合。针对面粉中毒麦成分的检测,SNP技术为特异性检测毒麦成分提供了技术支持。

对于等位基因的鉴别(AD)分析中的每一个样本,使用唯一的一对荧光探针,例如,两个TaqMan-MGB探针来标记一个SNP位点。一个荧光探针与野生型(等位基因1)完全匹配,另一个荧光探针与突变完全匹配(等位基因2)。

等位基因鉴别分析将未知样品分为以下几类:纯合子 (样本只含有等位基因1或等位基因2);杂合子 (样本同时含有等位基因1或等位基因2)。

张姮等[8]首次在植物检疫上应用SNP技术对毒麦属6个种进行分型研究,SNP技术的强大的检测能力和检测量可以代替基因芯片技术,而它的成本比基因芯片要廉价的多。除此之外,同样是荧光标记,显示的图形是不同的,以曲线显示的检测图形如果在同一循环数开始出现“拐点”会出现重叠现象,而利用SDS 2.0(Applied Biosystems)软件程序进行终点分析,通过检测不同等位基因所标的FAM和VIC荧光强度不同所出现的点位(靠近Y轴或X轴)不同,图形清晰明了;由于使用的荧光标记不同,出现的图形背景也不同,由于SNP技术只以点为基线,不需要调整,背景也很清晰。

1.2PCR-RFLP技术

RFLP(限制片段长度多态性)是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生变化。

张姮等[9]利用此技术首次从分子水平上鉴定区分了毒麦属4个种。对毒麦属近似种的rDNA ITS序列的限制性内切酶酶切图谱分析,根据酶切图谱的差异选择合适的限制性内切酶BssSI、TfiI、NehI,人工分析RFLP带型图谱。

现在可应用于物种鉴定的分子生物学技术手段有很多,但有些技术由于操作复杂、成本高或其他一些因素,限制了应用范围。而PCR-RFLP技术由于其简单易行、周期短、费用低的特点成为实际应用中常选用的物种鉴定分子生物学手段[10]。

1.3芯片技术

生物芯片技术是20世纪90年代中期快速发展起来的分子生物学高新技术,是各学科交叉综合的新学科[11]。

基因芯片基本原理是将核酸片段作为识别分子,按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体的表面形成微点阵,利用反向固相杂交技术,将标记的样品分子与微点阵上的核酸探针杂交,以实现多到数万个分子之间的杂交反应,通过特殊的检测系统来高通量、大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因分子的存在[12]。

2008年,李文芬等[13]利用基因芯片技术检测地中海实蝇、纳塔尔小条实蝇和芒果小条实蝇。对于水果类害虫如实蝇,一般的实验室检测实蝇种类主要依靠培养和直接镜检等形态学鉴定,其操作繁琐、费时,并且需要高度的专业知识。地中海实蝇芯片技术为中国进口果蔬中检疫性实蝇快速筛查和种类鉴定提供了检测方法,为有害生物的快速检测提供了新方法。

基因芯片由于具有高通量、高度并行性、高灵敏度等优点而在各个领域得到了广泛的应用[14],包括有基因表达谱芯片,转基因农产品检测芯片,新生儿基因检测芯片,肝炎病毒、艾滋病毒基因检测芯片等,其中肿瘤检测、肝病检测、自身免疫疾病诊断芯片即将或已经进入临床应用和商业化运作[15]。物种鉴定检测芯片研制也在起步当中,如应用于临床致病真菌鉴定[16]和水产食品中常见病原微生物鉴定[17]等,因此,在面粉中毒麦成分检测方面也有其应用价值。

2化学检测技术应用

化学检测技术在国内外普遍应用于检测毒素和化学成分,早在1993年国外就有对毒麦碱进行检测的记录。

2.1气相色谱分析法

1993年,Mark R. TePaske等[18]通过气相色谱分析法从被内生菌感染的羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、针茅属(Stipa)和早熟禾属(Poa)的样品中检测出不同浓度的毒麦碱。

气相色谱法所分析的物质需要在操作温度下能气化而不分解。毒麦碱的沸点在760 mmHg 下为224.2 ℃,蒸气压25 ℃条件下为0.092 6 mmHg,适应于气相色谱。

Mark R. TePaske等人采用含有火焰离子探测器的Hewlett-Packard 5980A的气相色谱仪进行分析。探测器完整地用光谱物理学SP4290积分仪所反应。在样品的处理方面,过滤种子的抽提剂由CH2Cl2/MeOH/NH4OH组成,以75∶25∶0.5的比列配制。苯基吗啉作为一种内在标准通常直接用于气相色谱分析。把苯替吗啉标准液(50 μg/mL)和抽提剂加入被磨成粉末状的原料(10 mL/g)中,并一起放入螺帽玻璃盖的离心分离管中。用线纹的锡箔纸紧紧的密封,在室温下放入定轨摇床中一整晚(16 h)。混合物离心(2 500 rpm,25 min)后,取1 mL移入螺帽小瓶。然后把样品密封在-15 ℃下保存,以用于气相色谱法。

2.2高效液相色谱法

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9×107 Pa),使流动相在高压下快速流动,以提高分离效果;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。

高效液相色谱法由于其分析速度快、分离效能高、自动化等优点,广泛应用于各类产品的化学成分检测及鉴定,如奶粉中三聚氰胺的检测[19]。用此方法时,高效液相色谱仪额外需要配有紫外检测器或二极管阵列检测器,试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用高效液相色谱测定,外标法定量。制作标准曲线时用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度为0.8,2,20,40,80 μg/mL 的标准工作液,浓度由低到高进样检测,以峰面积—浓度作图,得到标准曲线回归方程。

2.3液质联用法

液质联用法具有特异性好、灵敏度高的特点,在对化学成分进行检测时,不仅能对其进行定量测定,还能进行定性确证,可用于面粉中毒麦碱成分的确证分析。

2006年,岳振锋等[20]研究建立了牛奶样品中10种四环素类多残留的高效液相色谱串联质谱确证方法,为牛奶样品中四环素类药物及其代谢产物残留的监督检验和残留监控提供技术了支持。2008年,中国也建立了奶粉中三聚氰胺成分检测的国家标准[19],试样用三氯乙酸溶液提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证,外标法定量。待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。用此方法时,液相色谱-质谱/质谱仪应配有电喷雾离子源(ESI)。制作标准曲线时,取空白样品按照应检样品同样的处理方法处理,用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度为0.01,0.05,0.1,0.2,0.5 μg/mL 的标准工作液,浓度由低到高进样检测,以定量子离子峰面积—浓度作图,得到标准曲线回归方程。

3结论

随着全球农产品贸易的日益频繁,可能存在于面粉中的毒麦成分越来越引起人们重视。面粉是人类最主要的食物之一,面粉安全尤为重要,只要有一批面粉中携带有毒麦成分,就会造成重大事故,因此,对面粉中毒麦成分的检测意义重大。

综合目前的检测手段,虽然检测方法丰富,但都有其优势与不足,对于检测方法中准确率高的检测方法,目前尚未建立。笔者通过对相关的一些检测方法的分析,旨在总结出可行性高、低成本、高效益、经济方便的毒麦成分检测方法,建立快速检测面粉中毒麦成分的体系。

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