核酸分子杂交技术在环境微生物研究中的应用
摘要： 介绍环境微生物研究中包括荧光原位杂交技术在内的核酸分子杂交技术在环境微生物监测、环境微生物分类和环境微生物治理污染中的应用。核酸分子杂交技术在研究环境微生物中发挥重要作用，大大扩展环境微生物学的研究空间。
关键词： 环境微生物；核酸分子杂交技术；应用
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1671－7597（2011）0520133－02
0 引言
核酸分子杂交是上世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术，是一种基于DNA分子碱基互补配对的原理，用特异性的cDNA探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，使其广泛应用于环境微生物的检测，以及定性、定量分析它们的分布、丰度和适应性等研究[1]。
核酸分子杂交技术一般可分为窄缝杂交法、印迹转移杂交法及原位杂交法。窄缝杂交由于特导性及加样准确性较差，现已较少应用。印迹转移杂交是用放射性同位素探针与滤膜上的DNA或RNA分子杂交，经显影曝光显示印迹，可分为Southern印迹杂交和Northern印迹杂交，分别用于检测DNA和RNA样品。原位杂交法是将经过标记的探针加在组织切片（包括染色体）上，进行显微照相检测目标基因或目标序列在染色体上的位置。
本文主要以荧光原位杂交技术（Fluorescent in situ hybridization，
FISH）为例，介绍了该技术的基本原理、操作过程及其在群落多样性、不同种群的空间联系及功能研究等方面的应用，并对其他几项常用的杂交技术在环境微生物领域的应用进行了介绍和评述。
1 荧光原位杂交及其在环境微生物研究中的应用
1.1 概述
自Giovannoni于1988年首先利用放射性标记的rRNA寡核苷酸探针对细菌进行显微探测以来，随着具有较高安全性的标记技术的发展，DeLong于1989年首次应用荧光标记寡核苷酸探针探测独立的微生物细胞，此项技术即荧光原位杂交（FISH）。该技术是一种根据核酸探针杂交原理，应用非放射性荧光物质在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。通过在环境样品上直接原位杂交，既可测定不可培养微生物的形态特征及丰度，又可分析其空间及数量分布。由于FISH具有在测定过程中不破坏细胞、分辨率高、特异性强、安全快速等优点，该技术正逐渐在环境微生物研究中被广泛应用。
1.2 原理
FISH技术是利用一小段用荧光物质标记过的寡核苷酸序列（一般为15～30个碱基）为探针，将其直接投加到环境样品中，利用其与样品中同源性微生物细胞内的靶DNA互补配对特性，经变性退火复性形成探针与靶DNA的杂交体，在荧光显微镜下直接观察和检测特定微生物的数量与分布。由于16SrRNA在活性微生物体内功能稳定、分布广泛，且在系统发育上具有高度的保守性，FISH技术通常选择它作为杂交的靶标分子。再根据该分子的某段特异性序列，设计相应的寡核苷酸探针，经荧光检测系统就可实现对待测DNA进行定性、定量或相对定位等分析[2]。
1.3 FISH技术在环境微生物研究领域的应用
1）FISH技术在除磷细菌、硝化细菌研究中的应用
除磷细菌和硝化细菌在除磷或脱氮工艺中有重要的研究意义，但除磷细菌和某些硝化细菌难以用常规方法进行培养，因此应用传统方法无法对其进行深入研究。有些硝化细菌即使能够培养，也由于所用的培养基具有选择性，使得某些易于培养的菌株，如Nitrosomonas europaea等在培养基中处于竞争优势，致使得到的优势类群与样品中的实际情况有较大差异。近年来，FISH技术的应用克服了上述困难。
Mamoru对除磷工艺的FISH研究中，应用ALF1b、HGC和Bet42a探针检测出的细菌量所占比例分别在10%～64%；应用MP2和CF探针探测到的细菌含量在4%以下。在强化除磷（EBPR）工艺中，无论在厌氧或好氧区的活性污泥中都存在着丰富的除磷微生物，如Bet Proteobacteria亚类的Actinoba
cteria、Epbr15、Epbr16和GPBHGC等常见类群。据J R Liu的报道[3]，应用FISH技术在EBPR工艺中探测到的Rholocyclus也是生物除磷的优势种群。
Wagner和Bruce E R等[4，5]研究了一套较完善的对硝化细菌检测的FISH技术，后来随着硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出，FISH技术也被广泛地应用于活性污泥系统、膜生物反应器和硝化流化床反应器等污水处理系统中。
2）FISH技术在环境微生物功能研究中的应用
FISH除了在微生物种群监测方面发挥作用外，还可应用在对特定功能菌的发现和分布研究上，用某一类功能酶的保守序列作探针，则对环境中的功能微生物菌群进行监测。如据Bergquist P L等的报道，用纤维素酶的保守序列作探针，就可以研究环境中具有纤维素降解能力的微生物的分布[6]。Bot he H等用NSO190或NSO1225作探针，可检测出环境中的氨氧化细菌的存在[7]。Jiang等应用FISH技术对SBR反应器内好氧颗粒污泥苯酚降解菌群分布进行了研究，结果阐明好氧颗粒污泥内PG-01菌株的丰度和空间分布[8]。
2 其他核酸杂交技术及其在环境微生物研究中的应用
2.1 数量印迹杂交（quantitative dot blot）技术
应用数量印迹杂交，可获得环境样品中特定DNA序列的丰度信息。利用通用型探针和专一性探针与环境样品中的总DNA和特定类群DNA进行杂交，由其信号的比值来反映某类特定微生物菌群的相对丰度，还可间接反映该类微生物的相对生理活性。
Monique等[9]利用MPH-730（通用型探针）和MPHm-994（专一性探针）两种探针以测定噬甲基菌属（Methylophaga）和海洋中的噬甲基菌属的相对丰度，结果发现噬甲基菌属在海洋沉积物中广泛存在。以16SrRNA为探针的数量印迹杂交在许多研究应用中获得成功，但由于rDNA是一种串联重复基因，在不同生物中的拷贝数不一，故在某些杂交研究中可能会造成较大误差。
2.2 印迹转移杂交技术
印迹转移杂交包括Southern和Northern印迹杂交技术，应用于样品中的DNA和RNA样品，以前者在环境微生物研究中应用较广。Southern杂交的原理是从环境样品中提取细菌总DNA，用限制性核酸内切酶切割、电泳，将条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上与DNA或RNA探针杂交，从杂交条带的数量推知功能微生物菌群的丰度。相对于原位杂交，其步骤略为繁琐，但其在环境微生物群落结构的监测中仍被广泛应用。
2.3 基因芯片（Microarray）技术
作为核酸杂交技术应用和生物芯片技术发展的分支，基因芯片首次于1991年由Fodor S P A等人提出[10]，现已成为国内外研究的一个热点。
基因芯片是将大量核苷酸探针以点阵列方式高密度地排列于特定的支持物上，如硅片、玻片、薄膜等，与样品DNA杂交后通过激光共聚焦等技术分析靶DNA的存在和相对含量的现代分子生物学方法。若将某一分类单元的特异DNA片段或功能基因的保守片段作为探针整合在芯片上，则可以对环境样品中的微生物结构与功能进行监测分析[11]，如16sRNA基因芯片。
对于环境微生物研究的基因芯片，可以分为3类[12]。一是生化循环过程关键酶（如去硝化）的功能基因芯片，可用于检测自然环境中微生物群落的生理地位和功能。二是由含有源于核糖体核酸（rRNA）基因探针的系统发育的寡核苷酸芯片，应用于微生物群落的系统发育分析。三是构建纯培养微生物群落基因组芯片，根据可培养成分反映微生物群落。
3 结语
随着对环境微生物研究的深入， 核酸分子杂交技术在环境科学领域中的应用日益广泛，大大扩展了环境微生物学的研究空间，包括环境微生物种群监测、分类和微生物治理污染尤其是环境微生物功能的研究等。
核酸分子杂交技术直接在样品和微生物群落、生理功能特征两者间构建信息桥梁，除了能够弥补传统方法对于难以培养环境微生物研究的瓶颈外，还能更为客观地反映微生物在自然或人工系统中的状况，为环境监测和污染治理提供更具实际应用价值的参考信息，对于深入、完整地进行环境微生物研究具有重要的理论和现实意义。
参考文献：
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[2]Wagner M，Amann R，Lemmer H，et al，Probing activated sludge with oligonucleotides specific for proteobacterial： inadequacy of culture- dependent method for describing microbial commmanity structure[J].App l Evir Microbiol.，1993，59（5）：1520-1525.
[3]J R Liu and R J Seviour. Design and application of oligonucleotide probes for fluorescent in situ identification of the filamentous bacterial morphotype nostocoida limicola in activatedsludge [J].Environ.Microbiol，2007，3：551-560.
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[9]Monique J， B atrice R. Development and use of fluorescent 16SrRNA-targeted probes for the specific detection of Methylophaga species by in situ hybridization in marine sediments. Research in Microbiology，2003，154：483～490.
[10]Fodor S P A，Read J I，Pirning M C， et al . Light-directed，spatially addressable parallel chemical synthesis [J].Science，1991，251：767-773.
[11]Zhou J Z. Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis. Current Opinon in Microbiol.，2003，6：288-294.
[12]Zhou J，Thompson D.Microarrays：applications in environmental microbiology[M].In Encyclopedia of Environmental Microbiology，vol4.Edited by Bitton G.New Youk：John Wiley & Sons，2002：1968-1979.
作者简介：
童英林（1980-），男，汉族，广东惠阳人，硕士研究生，助理实验师，仲恺农业工程学院环境科学与工程学院，研究方向：环境科学与工程。