9种植物粗提总黄酮的体外降脂及抑制非酶糖基化的活性

摘要：为了研究9种植物粗提总黄酮的体外降脂及抑制非酶糖基化的活性，分别将9种植物样品经粉碎、脱脂、脱色处理后，用超声辅助70%乙醇浸提，真空过滤浓缩后得粗黄酮。以芸香苷为标准样品，用紫外分光光度法测其在 510 nm 处吸光度并绘制标准曲线，计算样品中黄酮含量。随后进行体外降脂试验，通过比较有无抑制剂（提取液）加入的情况下，脂肪酶的活性差异、所得各提取物对脂肪酶的抑制率，比较降脂活性大小。之后进行体外非酶糖基化试验，1 mL 提取液（加氨基胍做阳性对照，加水做阴性对照）与 1 mL 磷酸缓冲液混合，90 ℃水浴 40 min；然后与乙二醛和牛血清白蛋白混合，反应液于 37 ℃条件下孵育 15 d，用荧光法在发射波长 440 nm 激发波长 365 nm 处测定糖基化产物的自发荧光值，计算9种植物粗提黄酮对体外非酶糖基化反应的抑制率，结果表明9种植物黄酮粗提物对脂肪酶均有较强的抑制作用，其中蛇接骨草抑制活性最强。在体外非酶糖基化试验中，9 种植物对非酶糖基化终产物的生成均有较强的抑制作用，其中芦荟黄酮非酶糖基化抑制活性最强。

关键词：黄酮；降脂活性；抑制；非酶糖基化

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0291-03

收稿日期：2013-09-24

基金项目：国家自然科学基金（编号：31160319）；江西省高等学校科技落地计划（编号：KJLD13027）；江西省教育厅科技计划（编号：GJJ13281）。

作者简介：李楠（1989—），女，内蒙古满洲里人，硕士研究生，研究方向为分子营养学。E-mail：296875131@qq.com。

通信作者：王文君，博士，教授，研究方向为食品化学与分子营养学。E-mail：wwjun9999@sina.com。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物体内具有C6—C3—C6 基本骨架的化合物，已发现的黄酮类化合物有9 000多种[1]。它是生物体内除蛋白质和核酸以外的一类重要生物分子，尤其是一类重要的信息分子，具有多种多样的生物功能。现代研究证明黄酮类化合物具有扩血管、降血脂、抗凝血、抗炎、抗肿瘤、镇痛以及非酶糖基化等广泛的药理活性[2]，因此成为目前重点研究的植物化学成分之一。

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，是由于胰岛素缺乏或相对缺乏而形成持续性高血糖症。这种持续性的高血糖症可以导致一些组织器官的代谢异常，产生功能障碍及形态的异常，从而引发众多慢性并发症。目前认为在高血糖的情况下，机体组织的许多重要蛋白质发生非酶糖基化反应是糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一[3-4]。非酶糖化反应是蛋白质和葡萄糖在体内发生酶促反应形成 Schiff 碱和Amadori产物等早期产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的一系列复杂反应。有效控制高血糖，寻找干预非酶糖基化过程的措施，减少糖基化终末产物的形成是防治糖尿病慢性并发症和其他老年性疾病的一个可行且有效的方法。抑制蛋白质非酶糖基化已成为药物开发的一个重要靶点[5-7]。医学药物学研究证实氨基胍可以有效抑制蛋白质的糖基化反应[7]。黄酮类化合物对人体具有多种潜在的生物活性，如抗癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗衰老、增强免疫力、防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病等，且对 AGEs 的生成也有一定抑制作用。

青钱柳（Cyclocarya paliurus）、银杏（Ginkgo biloba）、绿茶（Camellia sinensis）、芦荟（Aloe vera var. chinensis）、荷叶（Folium nelumbinis）、蛇接骨草（Gynura procumbens）、菝葜（Smilax china）、鱼腥草（Houttuynia cordata）、三叶草（Trifolium repens）等9种植物都属于自然中常见的实用性较强的天然植物，有些还是药食同源植物。本研究探讨了9种植物粗黄酮的体外降脂活性和其对非酶糖基化的抑制作用，以期为其药用价值的开发利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

青钱柳、银杏、绿茶、芦荟、鱼腥草、荷叶、蛇接骨草、菝葜、三叶草，都来源于江西农业大学植物园。

1.2主要试剂

氢氧化铝、聚乙烯醇、三油酸甘油酯、乙二醛均购自天津永大化学试剂，胰脂肪酶、氨基胍和标准牛血清白蛋白购自 Sigma 公司。

1.3主要仪器

电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；RE-52A 旋转蒸发器（上海亚荣生物化仪器厂）；SHE-III 型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；SP-754PC 型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；960 型荧光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；KQ3200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-6 电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.4试验方法

1.4.1黄酮的提取植物烘干至恒重后粉碎过 70 目筛，称取 100 g 用石油醚按料液比1 g ∶10 mL浸提过夜脱脂脱色，蒸干备用。准确称取处理后样品50 g，超声辅助70%乙醇浸提（料液比1 g ∶10 mL，70 ℃，60 min，100 W），真空过滤后，将滤液进行真空浓缩至约20 mL，得总黄酮粗提取物。用70%乙醇将粗提黄酮定容至100 mL容量瓶得样品总黄酮溶液，再从100 mL中取5 mL溶液用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中为备用液。

1.4.2体外降脂试验降脂试验根据霍世欣等的方法[8]稍有修改。脂肪酶催化脂肪分解，生成脂肪酸，以酚酞作指示剂，用 0.05 mol/L NaOH 溶液滴定。通过比较有无抑制剂（提取液）加入的情况下，脂肪酶活性的差异，可得提取物对脂肪酶的抑制率，体现降脂活性的大小，并与含量进行相关性比较。

抑制率=抑制脂肪酶活性/脂肪酶活性×100%（1）

脂肪酶活性测定法：取 100 mL 三角瓶，加入 5 mL 0.025 mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.4）和 4 mL 聚乙烯醇三油酸甘油酯乳化液（0.22 g/mL 聚乙烯醇，油酸甘油酯 1 mL 混合，高速搅拌均匀，得乳白色乳化液）作为底物，置于 37 ℃水浴中反应 10 min。加入 1 mL 脂肪酶（2 mg/mL），准确反应 15 min 后，加95%乙醇终止反应。加酚酞 2 ～3 滴，用 0.05 mol/L NaOH 标准溶液滴定至微红色，平行试验3次。空白试验的酶液在反应终止后加入。

1.4.3糖基化试验在蛋白质非酶糖基化反应体系中加入粗提黄酮进行药物干预试验，分别于1、3、6、9、12、15 d用荧光分光度计测定荧光值，绘制动态曲线，加氨基胍作阳性对照，加水作阴性对照，进行抑制能力分析；以氨基胍作参比，计算粗提物对非酶糖基化终末产物的抑制率，并与含量进行相关性分析。具体试验过程如下：

（1）反应液配制：根据文献[9]的方法稍加修改，将乙二醛（GXL）12 mg/mL、牛血清白蛋白（BSA）20 mg/mL和EDTA 1 mol/L，在pH值7.4的磷酸缓冲液（PBS）0.2 mol/L中混合而成，备用。

（2）蛋白质非酶糖基化的药物干预试验：根据文献[10]的方法稍加修改，将提取液1 mL（浓度为1 mg/mL）与PBS 1 mL 在90 ℃下混合，40 min（以去除乙醇）后加入反应液 1 mL，分别于37 ℃ 水浴避光孵育1、3、6、9、12、15 d，重复3次。氨基胍1 mL（0.1 mg/mL）与反应液做阳性对照，蒸馏水 1 mL 与反应液作空白对照。

（3）抑制率的测定：根据糖基化终产物有自发荧光的特性，采用荧光法测定荧光值，将抑制率与含量进行相关性分析。测定条件：激发波长365 nm，发射波长440 nm[11]，狭缝10 nm，灵敏度1。

I=（B-A）/A×100%（2）

式中：I为抑制率，A为空白对照荧光强度，B为样品荧光强度。

2结果与分析

2.1体外降脂试验测定结果

蛇接骨草提取物的体外降脂效果最好，抑制率达到72.57%，最低的是荷叶，抑制率仅为 30.64%，两者差异极显著（P<0.01），其他植物的抑制率依次为芦荟>绿茶>三叶草>银杏>菝葜>青钱柳>鱼腥草。

种植物粗黄酮降脂效果

样品抑制率（%）青钱柳36.74±9.77Bbc银杏47.51±6.85Bb芦荟66.73±12.7Aa荷叶30.64±8.06Bc蛇接骨草72.57±4.68Aa菝葜41.10±14.06Bbc鱼腥草32.39±3.24Bc三叶草64.75±4.10Aa绿茶66.51±1.61Aa注：同列数据后不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.2非酶糖基化试验测定结果

随着时间的延长，荧光强度逐步增高，各提取物的抑制能力增强。在15 d时，抑制糖基化反应能力最强的是芦荟黄酮提取物，其抑制率达到95.37%，另外银杏黄酮达到80.46%、绿茶黄酮达到80.51%，与氨基胍抑制率相当。表29种植物粗黄酮抑制糖基化结果

样品抑制率（%）1 d3 d6 d9 d12 d15 d青钱柳16.42±4.06**41.39±2.54**53.31±3.24*62.92±2.9267.06±0.6972.72±0.62银杏13.82±3.85**56.34±3.57*67.59±3.4265.96±4.9374.92±7.3280.46±6.94绿茶13.44±1.66**53.66±3.57*66.14±3.0778.06±4.8178.41±1.6780.51±3.87蘆荟78.43±1.4880.21±1.9686.79±4.3189.07±3.2794.89±1.9295.37±4.21*荷叶21.13±1.52**46.34±3.57**55.93±3.50*64.20±4.4365.87±1.3767.49±3.02蛇接骨草10.37±14.84**14.62±4.79**18.12±14.98**27.18±6.68**37.70±8.26**44.10±3.55**菝葜18.03±6.19**36.45±6.08**55.86±1.14*56.07±3.39*58.02±2.3462.31±2.77三叶草25.30±9.52**26.22±6.81**26.79±1.23**26.90±11.96**27.08±17.42**28.08±9.32**鱼腥草20.15±3.45**39.16±2.15**42.56±3.54**50.86±8.06*53.45±9.81*63.15±5.68氨基胍71.72±3.8874.76±4.1280.28±2.4080.36±5.5982.22±6.9484.26±1.95注：与氨基胍相比，*表示P<0.05，** 表示P<0.01。

3讨论

本研究黄酮对脂肪酶活性抑制作用测定的方法为滴定法，利用脂肪酶催化脂肪水解为脂肪酸和甘油，再使用标准碱溶液结合指示剂对产物脂肪酸进行酸碱滴定（或直接用pH酸度计代替指示剂），由耗碱量求出脂肪酶的活性。耗碱量少，说明脂肪酸产生量少，推断脂肪酶活性受到抑制。在本试验中，加入黄酮试验组消耗的NaOH少于未加植物黄酮试验组，9种不同植物中提取的黄酮均对脂肪酶活性有一定抑制作用，能减少体内游离脂肪酸的产生，表明黄酮可能通过抑制脂肪酶活性降低血脂水平，从而在一定程度上能预防心血管等相关疾病。

蛋白质糖基化在糖尿病血管并发症的发生中占有非常重要的地位。在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基酸可以与还原糖的羰基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生一组稳定的糖基化终产物（AGEs）[12]。研究表明，渗出血管的可溶性蛋白与血管基质成分通过AGEs互相交联，如血浆低密度脂蛋白（LDL）渗出与血管壁细胞交联堆积，影响LDL弥散出内膜而产生血管病变。血浆蛋白与肾小球底膜交联，引起毛细血管基底膜进行性增厚和微血管阻塞[13]。

以往人们对糖尿病的治疗重点放在对血糖的控制上，但随着研究的深入，蛋白质非酶糖基化反应与糖尿病并发症的关系日益受到人们的重视。体内蛋白质的非酶糖基化反应与很多并发症的病理机制有关，如糖尿病酮症酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性肾病等。蛋白质非酶糖基化并不会因为血糖得到控制而停止，依然会造成糖尿病慢性并发症的发生和发展，即所谓的“高血糖记忆”状态。通过阻断非酶糖化反应从而防治上述疾病的发生发展是近年来药物治疗学领域研究的新方向[14]。

黄酮具有多种生物活性，如抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等。本研究对 9 种天然植物的黄酮提取物进行了体外降脂和非酶糖基化的研究。发现蛇接骨草、绿茶、三叶草的体外降脂作用比较明显；而非酶糖基化的研究表明芦荟对非酶糖基化的抑制率较高，且各种植物黄酮提取物对非酶糖基化的抑制率都随着时间的延长而增强，与文献[15]报道一致。尽管体外试验表明 9 种植物的黄酮具有体外降脂和对非酶糖基化抑制作用，但黄酮对 AGEs 的抑制作用机制目前研究的不是很清楚，还有待进一步研究。

4结论

试验中9种植物的黄酮提取物均对脂肪酶有一定的抑制作用，绿茶、蛇接骨草、三叶草对脂肪酶抑制率均在60%以上，其余的多在30%～50%之间。这些植物提取物的抗氧化作用机制可能是因为黄酮类化合物能减少自由基的产生和清除自由基，从而抑制脂质氧化。

从非酶糖基化试验中可以看到，观察1～15 d的抑制率记录可发现，随着时间的延长，各样品的荧光强度逐步增高，提示各提取物的抑制能力增强。且观察15 d时的最终抑制率可发现，除了三叶草，其他植物的黄酮提取物均对蛋白非酶糖基化反应具有一定的抑制作用，其中以芦荟的抑制作用最强，抑制率均达到95%以上。

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