ClC—3荧光真核表达载体的构建及表达
[摘要] 目的 构建表达ClC-3的荧光真核表达载体，为研究其在肿瘤细胞中的作用提供分子工具。 方法 将ClC-3的编码序列亚克隆到pEGFP-N1质粒，构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，利用脂质体介导将ClC-3基因导入人乳腺癌细胞MCF-7内，通过绿色荧光观察检测基因的表达。 结果 成功构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，该载体转染MCF-7细胞后，可观察到绿色荧光。 结论 表达ClC-3的荧光真核表达载体构建成功，并在乳腺癌细胞中得到正确表达，为进一步研究ClC-3在乳腺癌中的作用奠定了基础。
[关键词] ClC-3；MCF-7细胞；荧光真核表达载体；转染
[中图分类号] R737.9，R453 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）10（b）-0004-03
ClC-3是ClC氯离子通道家族成员之一，对维持细胞容积平衡、调节细胞电活动等多种生理功能发挥重要作用，是正常细胞生长和增殖必不可少的元件。近年有文献报道，在宫颈癌、乳腺癌和恶性胶质瘤中ClC-3的表达都远高于正常组织[1]，ClC-3可以通过参与细胞体积减小即凋亡性容积减小（apoptotic volume decrease，AVD）的过程来参与肿瘤细胞的凋亡调控[2]，而且还可能参与了肿瘤细胞周期依赖性的细胞迁移过程[3]。因此，ClC-3可能是与肿瘤的发生发展、转移和凋亡过程密切相关的关键分子之一。本研究采用基因重组技术构建ClC-3与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的融合蛋白ClC-3-EGFP，并检测其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达，为进一步探讨ClC-3在乳腺癌中的作用提供分子工具。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
携带ClC-3全长cDNA的质粒pcDNA3.1/ClC-3由芝加哥大学Deborah J.Nelson教授惠赠；真核表达质粒pEGFP-N1、大肠埃希菌DH5α、乳腺癌细胞株MCF-7为本实验室保存；内切酶BamHⅠ、SacⅠ，T4 DNA连接酶均购自NEB公司；LA Taq酶购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。
1.2 PCR扩增ClC-3的编码序列
以质粒pcDNA3.1/ClC-3为模板，用PCR扩增出ClC-3的编码序列，上游引物序列为5′-CTTAGAGCTCATGGAG-TCTGAGCAGCTGTT-3′，引入了Sac Ⅰ位点；下游引物序列为5′-CAGTGGATCCATGTTGAACATTATTGAAGCGG-3′，引入了BamH Ⅰ位点。PCR反应体系：50 μl体系中模板DNA 0.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μl，LA Taq（5 U/μl）0.5 μl，2×GC Buffer Ⅰ 25 μl，dNTP Mix 8 μl，ddH2O 12 μl。反应参数：94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，30个循环，最后72℃延伸10 min，产物2476 bp。反应结束后0.8%琼脂糖凝胶电泳观察结果及切胶回收目的DNA片段。
1.3 ClC-3荧光真核表达载体的构建和鉴定
PCR产物和质粒pEGFP-N1分别用Sac Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，回收ClC-3和pEGFP-N1线性化载体片段，然后T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，挑取阳性克隆，扩增培养细菌后提取质粒，Sac Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切处理进行鉴定，酶切鉴定正确的克隆送华大基因进行测序鉴定，获得pEGFP-N1/ClC-3真核表达质粒。
1.4 细胞培养
将乳腺癌细胞MCF-7放在含10%胎牛血清和0.01 mg/ml牛胰岛素的DMEM完全培养基中培养，置于37℃、含体积分数5%CO2饱和湿度培养箱。细胞每隔2 d传代一次，取对数生长期细胞进行培养。
1.5 脂质体法转染乳腺癌细胞和绿色荧光观察
收集细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，按1 ml/孔接种于24孔细胞培养板，待细胞达到70%～80%汇合度时，按说明书操作，用Lipofectamine 2000转染pEGFP-N1/ClC-3质粒。同时，以转染pEGFP-N1质粒作为空载体组，只加脂质体作为空白对照组。转染48 h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，并拍照。
2 结果
2.1 PCR结果
以pcDNA3.1/ClC-3为模板，PCR扩增来获得ClC-3的编码序列，通过优化扩增条件，得到了约在2500 bp处的一条DNA条带（图1）。
2.2 pEGFP-N1/ClC-3重组质粒的鉴定
pEGFP-N1/ClC-3用Sac Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后得到4.7 kb和2.5 kb两个片段（图2），符合预期大小，证实ClC-3 cDNA插入到了pEGFP-N1载体中。序列测定结果与报道序列完全一致，进一步证实了其正确性。
2.3 pEGFP-N1/ClC-3表达的鉴定
经脂质体介导，pEGFP-N1/ClC-3转染MCF-7细胞48 h后，倒置荧光显微镜下观察到带有绿色荧光的细胞（图3A），证明绿色荧光蛋白在MCF-7细胞中有表达，因EGFP基因位于ClC-3基因下游，两者形成一个融合蛋白进行表达，证明ClC-3基因在MCF-7细胞中也得到表达。转染空载体pEGFP-N1的MCF-7细胞可观察到更强的绿色荧光（图3B），而只加入了脂质体的空白对照组则没有观察到绿色荧光（图3C）。
3 讨论
ClC-3是颇受关注的ClC家族成员之一，哺乳动物的多种组织细胞都表达ClC-3，特别是在中枢神经系统、肠道及肾组织中呈高表达，主要定位在细胞质内的囊泡膜，在细胞膜上也有一定量的表达[4]。ClC-3的生理功能目前尚未完全清楚，可能通过容积激活性氯电流参与细胞容积的调节，从而参与细胞增殖、分化和迁移等过程。近年来研究发现，ClC-3与肿瘤的发生发展密切相关，研究报道ClC-3在肺癌、乳腺癌、膀胱移行细胞癌和人胶质瘤组织中高表达[5-6]，另有学者发现采用氯通道阻断剂三氯氧胺可以有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，且ClC-3反义寡核苷酸可以增强其抑制效果[7]。肿瘤细胞迁移能力的增强提示其转移能力的增加，抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞和宫颈癌HeLa细胞中ClC-3的表达可使细胞迁移率随之降低[3，8]，说明在这两种肿瘤细胞中ClC-3很可能促进细胞迁移过程。肿瘤多药耐药的发生是化疗失败的主要原因之一，研究显示，ClC-3的过表达能增强胰腺神经内分泌癌细胞对依托泊苷的耐药性[9]，抑制ClC-3的表达可以促进顺铂诱导人耐药卵巢癌细胞发生凋亡[10]，提示ClC-3可能也参与了抗肿瘤药物耐药性的调控。这些研究都显示ClC-3很可能参与了肿瘤的生长、转移和耐药等重要过程，为了研究ClC-3的分子生物学特性及其在肿瘤中的多种作用，本研究构建了ClC-3的真核表达载体。
ClC-3最早是在大鼠的肾脏组织中被克隆和鉴定的[11]，到目前为止，其克隆和表达的研究在不断取得进展。本实验所选的pEGFP-N1载体采用高效且功能强大的CMV启动子，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；GFP是一种全新的报告分子[12]，而所使用载体带有EGFP序列，它是经过优化的GFP的突变体，在紫外光激发下发射的绿色荧光强度是野生型的6倍以上，对活细胞生长和功能无明显影响；EGFP分子量小，能与目的基因形成融合表达，但不会影响目的基因的表达，可作为报告基因检测细胞的转染情况。本研究中ClC-3表达在N端，因此在下游引物设计时去掉了其终止密码。将重组质粒转染pEGFP-N1/ClC-3转染MCF-7细胞48 h后观察了细胞的瞬时表达情况，结果表明，转染成功的细胞在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，同时也表明ClC-3得到了正确表达。
总之，本实验成功构建表达人ClC-3的荧光真核表达载体，通过脂质体介导在乳腺癌细胞中得到正确表达，该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察ClC-3的表达和定位，为进一步研究ClC-3在乳腺癌中的作用奠定了基础。
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（收稿日期：2013-07-31 本文编辑：林利利）