橡胶树根际2株产ACC脱氨酶促生菌的分离鉴定
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摘 要 橡胶树死皮是制约天然橡胶产量的重要因素，其发生与刺激割胶时乙烯利用量过度有关，具有1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脱氨酶活性的土壤微生物可以分解利用ACC（乙烯前体）来刺激植物生长发育。本研究从橡胶树根际土壤中筛选有助于减轻橡胶树死皮发生，并对其防控有一定应用前景的菌株。本文采集了橡胶树主要种植区（海南、云南和广东）的根际土壤样品，以ACC为唯一氮源进行筛选，共分离橡胶树根际细菌152株，并测定其ACC脱氨酶活性大小，将活性较强（0.226、0.164 U/mg）的2个菌株命名为HBRM-86和HBRM-16；结合常规形态学观察、生理生化特征分析及分子鉴定，将HBRM-86和HBRM-16分别鉴定为产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）和粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）；测定2株菌株促生潜能，结果发现其具有较好的促生潜力，进一步研究将为死皮防控药物研发提供新的思路。
关键词 橡胶树；根际促生菌；ACC脱氨酶；分离鉴定；促生潜能
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
橡胶树死皮（Tapping panel dryness，TPD）是天然橡胶生产中出现的一种割线局部或全部不排胶症状，其在国内外橡胶园发生普遍且危害巨大，发生率在14%～30%之间，局部地区可能高达50%左右[1]，已经成为制约天然橡胶产量的主要因素之一。目前关于橡胶树死皮防控的研究主要是物理和化学防治[2-3]，生物防治少见报道。关于TPD发生机理的假说国内外有很多[4]，而其中蔡磊等[5]提出的“乙烯诱导死皮说”随着乙烯利刺激割胶新割制的全面推行越来越得到认可。有一种具有ACC脱氨酶活性的植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）可以降低乙烯含量，这种PGPR体内含有ACC脱氨酶，将根系分泌物和植物体内合成的ACC作为氮源而利用，因而植物根表ACC浓度降低从而打破了平衡，导致根系ACC分泌量增加，植物体内ACC（乙烯前体物质）水平下降，刺激植物生长发育[6]，所以分离橡胶根际具有ACC脱氨酶活性的根际细菌对死皮进行防控是有意义的。
据文献报道有学者从小麦、玉米、豌豆、马铃薯、牧草等多种植物根际土壤中分离到具有促生作用的PGPR，这些菌株可以耐盐、抗旱、耐涝、修复土壤、提高植物抗病能力[7-14]。而且大部分PGPR通过分泌维生素、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、解磷、嗜铁以及利用ACC来促进植物生长[15-16]。所以，橡胶树死皮病也有可能通过具有促生作用的PGPR这一生物手段进行防控，目前未见关于橡胶树根际促生菌的相关报道。
本研究以“乙烯诱导死皮”这一假说为切入点，针对橡胶树生物防控这一薄弱环节，从橡胶林根际土壤中筛选出能利用乙烯前体（ACC）为唯一氮源的，能应用于橡胶树死皮防控的菌株，并对其进行深入研究，以期能开发出具有防控橡胶树死皮的生物菌剂或提取其活性物质，为橡胶树死皮防控药物研发提供一条新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 ACC购自安耐吉化学；铬天青（CAS）购自上海麦克林生化科技有限公司；磷酸钙购自索莱宝化学；DNA提取试剂购自北京天根生物技术有限公司；分子鉴定所需其他试剂均购自TaKaRa公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 土壤样品 本研究分不同批次采集了云南、海南和广州3个省18个橡胶树林段的根际土壤样品，其中云南5个，广州1个，海南12个；采集土壤样地涵盖8个橡胶树品种，分别是云研77-4、GT1、RRIM600、PR107、热研7-33-97、热研8-79、热研7-20-59和93-114；纬度18°21′36″N～24°9′36″N，经度98°1′12″E～111°22′12″E；海拔91～949 m。采样时间为2014年10月20日到2015年4月1日。
土样采集时，去除根系表面土壤，用无菌水清洗根部，然后剪成1 cm长短。采样时尽量选取细根，剪成合适长度用密封袋装好，4 ℃冰箱保存。取5个1 cm的根加入50 mL无菌水中，浸泡10 min，后轻微震荡处理5 min，制成土壤悬浮液[17]。
1.2 方法
1.2.1 产ACC脱氨酶菌株的分离纯化 参考黄盖等[17]的方法从采集的橡胶树根际土样中分离、纯化具有ACC脱氨酶活性的细菌并进行保存。
1.2.2 ACC脱氨酶活性测定 参考Peose等[18]的方法进行测定。
1.2.3 菌株鉴定 （1）菌株形态特征观察将筛选到的菌株接种在TSB平板上（温度28 ℃），培养24、48 h后观察菌落形态并采用十字交叉法测量菌落直径大小。
（2）菌株常规鉴定及生理生化特征参照《常见细菌系统鉴定手册》[19]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[20]进行分析。
（3）16S rDNA基因序列分析及系统发育树的构建参照试剂盒的方法提取菌株总DNA作模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA
G-3′）和1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），进行16S rDNA扩增，引物由上海立菲生物技术有限公司合成。PCR反应体系（30 μL）：2×Taq mix 15 μL，引物各0.5 μL，基因组DNA 1 μL，加水至30 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。
扩增出条带后切胶回收并进行连接转化，将阳性克隆送去上海立菲生物技术有限公司测序。将所得序列与NCBI数据库中的序列进行Blast分析，利用Mega 5.0软件中的邻接法构建系统发育树[21-22]。
1.2.4 菌株促生性能测定 产IAA能力测定参照Loper等[23]的方法测定。
嗜铁能力测定参照林超等[24]的方法测定，据嗜铁素螯合圈的大小初步判断产嗜铁素能力的强弱；晕圈越大，表示产嗜铁素能力越强；不产生晕圈，则表明不具有产嗜铁素能力[25]。
解磷能力测定参照Xiao等[26]的方法测定，根据解磷圈直径（HD）与菌落直径（CD）的比值（HD/CD）初步判定该菌是否具有解磷的能力[27]。
固氮能力测定参考夏娟娟[28]的方法测定。
1.3 数据处理与统计分析
本文使用Microsoft Office Excel 2010对产IAA能力的数据进行统计分析及制作一些相关图表，采用SAS 9.1软件进行Duncan′s检验分析（n=3）。
2 结果与分析
2.1 产ACC脱氨酶活性菌株的分离纯化
经过初筛、复筛、纯化（图1），从橡胶树根际土样中分离到具有ACC脱氨酶活性的菌株152株，并进行命名。
2.2 菌株ACC脱氨酶活性测定
通过对2.1中分离得到的152株菌株进行ACC脱氨酶活性测定得知，从橡胶树根际土壤中分离到的菌株的ACC脱氨酶活性范围是1.27×10-4～
0.226 U/mg，跨越了3个数量级。本文选取活性较高的2株菌株（HBRM-86和HBRM-16，ACC脱氨酶活性分别为0.226、0.164 U/mg）开展后续实验。
2.3 产ACC脱氨酶菌株的鉴定
2.3.1 菌落形态观察 培养48 h后（图2），HBRM-86的菌落为近圆形，不透明且边缘整齐，呈乳白色偏黄，中间凸起且颜色较深，边缘较薄，表面光滑、湿润、质地粘稠，易挑取，菌落平均直径为8.51 mm，24 h平均直径为6.27 mm；HBRM-16的菌落近圆形，不透明且边缘整齐，产红色水溶性色素，中间红色较深而边缘较浅，表面光滑，质地粘稠，易挑取，菌落平均直径为8.90 mm，24 h平均直径为6.80 mm。
2.3.2 菌株常规鉴定及生理生化特征 通过常规鉴定和生理生化特性分析，HBRM-86革兰氏染色、甲基红反应、苯丙氨酸脱氨酶、氧化酶、淀粉水解呈阴性，V-P检验、过氧化氢酶、柠檬酸盐呈阳性，可利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-甘露醇，能在pH值为4～13时生长，温度为20～45 ℃时可生长，NaCl耐性为10%；HBRM-16革兰氏染色、甲基红反应、氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶呈阴性，V-P检验、过氧化氢酶、淀粉水解、柠檬酸盐呈阳性，可利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、D-甘露醇，能在pH值为4～13时生长，温度为10～37 ℃时可生长，NaCl耐性为10%。具体生理生化特征见表1。查阅文献中关于细菌形态和生理生化特征的描述，将HBRM-86和HBRM-16初步鉴定为：产气肠杆菌（E. aerogenes）和粘质沙雷氏菌（S. marcescens）。
2.3.3 16S rDNA基因序列分析及系统发育树构建
以菌株HBRM-86和HBRM-16总DNA（图3）为模版，利用通用引物进行扩增，将扩增后的条带（图4）进行回收纯化、连接转化，测序得到的序列分别为1 556、1 414 bp。在NCBI上进行Blast比对，并挑选数据库高同源性菌株作为参比菌进行16S rDNA系统学分析，图5与图6显示了菌株的系统进化关系。比对结果显示菌株HBRM-86与 Enterobacter aerogenes KCTC 2190T（CP002824）序列相似性最高，达到99.85%，HBRM-86在系统发育树上也与KCTC 2190T聚在一起，亲缘性最高，可靠性达到99%；菌株HBRM-16与Serratiam arcescens sub sp. marcescens ATCC 13880T（JMPQ01000005）序列相似性最高，达到95%，HBRM-16在系统发育树上也与ATCC 13880T聚在一起，亲缘性最高，可靠性达到95%。
2.3.4 菌株鉴定结果 根据常规鉴定和分子鉴定结果，最终将HBRM-86和HBRM-16分别确定为产气肠杆菌（E. aerogenes）和粘质沙雷氏菌（S. marcescens），但是否为新的亚种还需要进一步验证。
2.4 菌株的促生潜力测定
2.4.1 产IAA能力测定 结果表明HBRM-86和HBRM-16都能显色，对2个菌株产IAA能力进行定量测定，测得2株菌的产IAA能力分别为19.007、3.883 ug/mL（图7）。由此可知，2株菌都具有产IAA能力，但产生的IAA能力差异性极显著（p<0.01），HBRM-86菌株产IAA能力强于HBRM-16。
2.4.2 嗜铁能力测定 菌株HBRM-16在CAS培养基上有明显的螯合圈，而HBRM-86则没有（图8），测定菌株HBRM-16螯合圈直径（D）与菌落直径（d），分别是27.8、9.59 mm，其比值（D/d）为2.90。说明菌株HBRM-16有一定的嗜铁能力。
2.4.3 解磷能力测定 通过平板接种实验发现HBRM-86的解磷圈很明显，而HBRM-16的相对较小，测定HBRM-86和HBRM-16菌株的解磷圈直径（HD）与菌落直径（CD），计算（HD/CD）分别为：1.79和0.17。实验表明2株菌株均有溶解无机磷的能力，但强弱不一（图9）。
2.4.4 固氮能力测定 2株菌株在无氮培养基上经过5次转接后，都能生长，但菌落直径较小（图10）。HBRM-16在无氮培养基上生长时产色素能力也有所减弱。
3 讨论与结论
本研究从采集的18个橡胶树根际土壤样品中分离到152株具有ACC脱氨酶活性的细菌，酶活范围是1.27×10-4～0.226 U/mg，有研究表明，当ACC脱氨酶活性不低于20 nmol α-KA/（mg·min）（即0.020 U/mg）时，可促进植物的生长[29]，结合所测数据得知分离的菌株中有46株可以促进植物的生长。分离的菌株中活性较高的HBRM-86和HBRM-16的ACC脱氨酶活性分别为0.226、0.164 U/mg。据报道，辛树权等[30]、黄盖等[17]、魏素娜等[31]、丁琳琳等[32]分离到的菌株ACC脱氨酶活性从0.016 7到8.893 0 U/mg不等。因此表明本文得到的菌株HBRM-86和HBRM-16的产ACC脱氨酶活性较高，从这一方面讲具有较高的研究价值。
据报道，一些学者已经从不同植物根际分离出多个有ACC脱氨酶活性的细菌，其分别属于不同的科、属[33]，该类菌的存在和分布具有一定的普遍性。多个种属根际微生物已有报道，主要是假单胞菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus），还包括产碱菌属（Alcaligenes）、节杆菌属（Arthrobacter）、固氮菌属（Azotobacter）、固氮螺菌属（Azospirillum）、肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、黄杆菌属（Flavobacteria）、哈夫尼菌属（Hafnia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）、黄单胞菌属（Xanthomonas）和慢生型根瘤菌属（Bradyrhizobium）等[34-35]。通过查阅文献[19]将HBRM-86和HBRM-16初步鉴定为产气肠杆菌和粘质沙雷氏菌，这也与分子鉴定的结果吻合。本文所鉴定的产气肠杆菌HBRM-86和粘质沙雷氏菌HBRM-16所在的肠杆菌属和沙雷氏菌属在其他植物根际土壤中已有报道[17]，但在橡胶树根际土壤中还未见报道，也未见将其应用于橡胶树的研究。粘质沙雷氏菌在水体和土壤中的广泛分布，亦是常见的条件致病菌[36-38]，在应用时有一定的局限性，后续希望通过克隆表达相关基因、分离纯化相关的活性物质、筛选无毒性突变菌株等手段，解除应用时的障碍。
PGPR一般通过分泌维生素、IAA、解磷与嗜铁等多种机制促进植物生长[15-16]。本文从产IAA、解磷、固氮和嗜铁4个方面的能力对2株菌株的促生潜力进行了测定，测定结果表明HBRM-86有较强的产IAA和解磷能力，但无嗜铁的能力；HBRM-16有较强的嗜铁能力，产IAA、解磷能力较弱。初步判断2株菌有一定的固氮能力，但仍需进一步检测。
结合前人研究结果和本研究测定结果表明，2株菌株均有较好的促生潜能，并在后续的橡胶树幼苗盆栽试验（未发表数据）中得到了验证，HBRM-86具有较好的产IAA和解磷能力可能是其促进橡胶树幼苗生长的关键因素，而HBRM-16促进幼苗生长的主要原因可能是对于铁元素的吸收能力较强，但这只是初步的预测，还需要在促生机理研究中进一步进行验证，另外，本文没有对解磷，固氮等进行定量测定，也需要在下一步的工作中进行补充。后续研究还将涉及2株菌株在橡胶幼苗中的定植情况，并对植株中的关键生理指标如ACC浓度、內源乙烯含量等进行测定，初步研发微生物菌肥并施用于死皮植株，测定橡胶树乳管再生的速度和能力，期待为死皮防控药物研发提供新的思路和参考。
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