白菜根肿病生防菌的筛选及防治效果评价
材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种及白菜品种
供试病原菌为黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense），均由本实验室保存。供试白菜为易感品种四季奶油小白菜，购自临沭县城关供销农资超市。
1.1.2 土壤样品
用5点取样法采集山东省临沂市兰陵县、山东省寿光市、河南省商丘市夏邑县土样共15份，装入自封袋中4℃保存[11]。
1.1.3 培养基
（1）PDA液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。（2）高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4· 7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.4～7.6。（3）LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0。固体培养基为每升液体培养基中加入15 g琼脂粉，121℃灭菌20 min[12]。
1.1.4 根肿病菌孢子提取
将罹患根肿病的白菜根用无菌水冲洗干净，切碎，加蒸馏水于组织磨碎仪内搅成匀浆，4层纱布过滤，滤液移入干净的50 mL离心管中，3 100 r/min离心15 min;弃上清液，沉淀重溶于50 mL灭菌水，3 100 r/min 离心10 min，重复3次;弃上清液，沉淀中加50%蔗糖溶液5 mL，混匀后3 100 r/min离心10 min，将上清液小心移入干净的离心管中，加30 mL灭菌水，3 100 r/min离心10 min; 弃上清液，沉淀重溶于30 mL灭菌水，3 100 r/min离心10 min，重复操作2次; 弃上清加无菌水制成每毫升含2×109个孢子的悬液，放于4℃冰箱保存备用[13]。
1.1.5 根肿病病土制备
将提取的根肿病孢子悬液和无菌土以1∶20的比例混合均匀，配成每克含1×108个孢子的病土，避光放于24℃培养箱培养48 h[14]。
1.2 试验方法
1.2.1 生防菌的分离
采用平板梯度稀释法分离土壤中微生物：称取土壤样品10 g于装有90 mL无菌水的灭菌三角瓶（300 mL）中，于28℃、200 r/min摇床振荡30 min得10-1 g/mL的土壤稀释液，按上述方法依次稀释制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 g/mL的稀释液。每个浓度分别取100 μL涂布于培养基上，重复3次，PDA和高氏一号培养基放于28℃恒温箱中倒置培养4～6 d用于分离真菌和放线菌，LB培养基放于37℃恒温箱中倒置培养1～2 d用于分离细菌，待各平板长出菌落后挑取单菌落重新接种于对应平板上分离纯化，分离出的土壤微生物于4℃冰箱备用。
1.2.2 生防菌的筛选
采用平板对峙筛选法。拮抗真菌的筛选方法：取28℃恒温培养5 d的病原指示菌菌饼（直径5 mm）倒置接种在PDA培养基平板（直径9 cm）中心，同时在距中央菌饼3 cm的圆周上对称接种分离出的真菌菌饼（直径5 mm）;拮抗细菌和放线菌的筛选方法：取28℃恒温培养5 d的病原指示菌菌饼（直径5 mm）倒置接种在PDA培养基平板（直径9 cm）中心，28℃培养2 d后在距中央菌饼3 cm的圆周上对称划线接种分离出的细菌或放线菌。以只接病原指示菌的平板为对照，3次重复，28℃恒温培养，待对照长满平板时，计算抑菌率[15]。
抑菌率（%）=（对照病原菌的菌落直径-处理病原菌的菌落直径）/对照病原菌的菌落直径×100
1.2.3 生防菌代谢产物制备
将筛选出的生防菌活化后接入液体培养基中，细菌用LB液体培养基培养，于37℃、200 r/min摇床培养1 d，真菌用PDA液体培养基于28℃、180 r/min摇床培养4 d，放线菌用高氏一号液体培养基于28℃、180 r/min摇床培养6 d。8层灭菌纱布过滤，滤液8 000 r/min离心20 min，上清液即为生防菌代谢产物。
1.2.4 生防菌对根肿病菌孢子的裂解率
取4 mL预先制备的根肿病菌孢子悬浮液同生防菌代谢产物上清液等体积混合装入15 mL灭菌离心管中，空白培养基与根肿病菌孢子等体积混合后作为对照，每个处理3次重复，置于25℃、200 r/min摇床振荡24 h，取样后用血球计数板计数形态完整的根肿病孢子数量并计算裂解率[13]。
裂解率（%）=（1-生防菌代谢产物上清液中形态完整的根肿病菌孢子数/空白培养基中形态完整的根肿病菌孢子数）×100
1.2.5 温室盆栽防病试验与防效评价
本试验于2019年2月14日至2019年3月15日在金正大生态工程集团股份有限公司智能温室内进行。取培养48 h的根肿病病土和无菌土按1∶10的比例混合均匀后分装到塑料钵（11 cm×8 cm×6 cm）中，每钵装土5 kg并栽种1棵育苗20 d的小白菜。分别在移栽时及移栽后10、20 d将筛选出的10 mL生防菌培养液和1 g 20-20-20水溶肥溶于300 mL水中浇于白菜根部，每种生防菌6 次重复，以空白培养基和冲施1 g 20-20-20水溶肥为对照。种植约30 d 后调查根肿病发生情况。
根肿病病情分级标准参照文献[16]：0级，根部无肿瘤;1级，侧根有小肿瘤;3级，主根肿大，直径小于2倍茎基部;5级，主根肿大，直径是茎基部的 2～3倍;7级，主根肿大，直径是茎基部的3～4倍;9级，主根肿大，直径是茎基部的4倍以上或肿瘤龟裂。
病情指数=∑（各级发病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级发病值）×100;
防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。
2 结果与分析
2.1 生防菌的筛选
从15份土壤样品中共分离出421株菌，其中细菌255株、放线菌101株、真菌65株。共筛选出18株对黄瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌均有较强抑制作用的生防菌，包括细菌（KB）11株、放线菌（KA）5株、真菌（KF）2株，抑菌效果见表1。其中放线菌KA-35对两种病原菌均有很强的抑制作用，抑菌率分别是78.67%和63.83%;细菌KB-94对黄瓜立枯病菌有很强的抑制作用（79.33%）;放线菌KA-3对香蕉枯萎病菌有很强的抑制作用（63.00%）。
2.2 生防菌对根肿病菌孢子的裂解率
18株生防菌中有8个生防菌代谢产物上清液对根肿病菌孢子的裂解率在30%以上（表2），其中放线菌株KA-35、KA-29和细菌菌株KB-244代谢产物上清液对根肿病菌孢子的裂解率分别达45.26%、42.11%和48.42%。
2.3 温室盆栽防治效果評价
选用对根肿病菌孢子裂解效果较好的KA-35、KA-29和KB-244菌株，通过冲施四季小白菜检测对根肿病的防治效果。结果（表3）表明，三个菌株均对根肿病有防治效果，其中放线菌株KA-35防效最好，为57.11%，单株地上部鲜重增加127.40%;细菌KB-244防效次之，为39.61%，单株地上部鲜重增加33.41%。
3 讨论与结论
本研究从土壤中筛选出了11株细菌、5株放线菌、2株真菌共18株对黄瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌都有较强抑制作用的生防菌，通过根肿病孢子裂解试验从中筛选出KA-35、KA-29和KB-244 3株生防菌用于盆栽试验，发现KA-35和KB-244能有效抑制白菜根肿病的爆发，且单株地上部鲜重较对照显著增加。多数生防菌在实验室内有较好防效，在田间应用时却不甚理想，主要原因是生防菌在农作物上难以定殖[17]。虽然KA-35和KB-244均来源于白菜根系，且在盆栽试验中能有效抑制根肿病的爆发，但其在大田中的效果还需进一步验证。
蒋欢等[18]发现土壤pH 4.50～6.50的弱酸性环境利于根肿病的发生，通过调节土壤pH值可以有效防治根肿病的发生。杨亨等[19]对绵阳28个油菜主栽品种进行抗根肿病鉴定及聚类分析，发现不同品种对根肿病的抗性不同，通过选育抗性品种可以降低根肿病的发病情况。可通过栽培前施用石灰、硅钙钾镁肥等调节土壤pH为中性或偏碱性，再结合栽培抗根肿病品种，移栽后冲施KA-35、KB-244、XF-1等生防菌株综合防治根肿病的发生。
放线菌能产生丰富的、活性多样的次级代谢产物，与人类生产、生活有着极为密切的关系，其天然代谢产物一直是现代医药业、农业和畜牧业中药物先导化合物的重要来源，如阿维菌素、链霉素、宁南霉素、多抗霉素等，在农业生产中有很重要的地位。应用其代谢产物防治植物病害，可减少农药用量，维系生态平衡，确保农业可持续发展[20， 21]。本研究筛选出的放线菌株KA-35不仅能抑制白菜根肿病的爆发，而且对黄瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌都有很好的抑制效果，后期将通过发酵优化、提纯对其代谢产物做进一步研究。
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收稿日期：2019-05-15
基金项目：山东省科技重大创新工程项目“设施蔬菜水肥精准施用关键技术研究与示范”（2017CXGC0205）
作者简介：刘振香（1989—），女，农艺师，主要从事农用微生物防治植物病害等研究。E-mail：liuzhenxiang@kingenta.com
通讯作者：胡红涛（1989—），男，农艺师，主要从事微生物肥料研制及应用方面的研究。E-mail： hht4275@163.com