响应面法优化脂肪酶非水相催化合成生物柴油
[摘要]利用固定化脂肪酶非水相催化油酸与甲醇合成生物柴油。在前期研究的基础上,采用响应面法优化影响催化体系的3个重要因素:酶添加量、有机溶剂量、底物摩尔比,获得最佳催化体系:在每g油酸加入0.568g的固定化脂肪酶及3.3mL的正己烷,油酸与甲醇摩尔比为1∶1.2。对响应面分析结果进行验证试验,结果表明转化率达到95.56%,与响应面预测值95.99%的吻合程度较高。
[关键词]脂肪酶响应面法生物柴油
﹡基金项目:福建省自然科学基金资助项目(2007J0217)。
﹡﹡通讯作者:郑毅,Email:eyizheng@fjnu.edu.cn
生物柴油是生物质能的一种形式,其主要成分是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。它是通过生物油脂中脂肪酸与短链醇(甲醇或乙醇)在一定的条件下反应得到的脂肪酸酯类物质。生物柴油作为生物燃料,是一种可再生能源,受到全球科学家的广泛关注。目前,工业上生物柴油的生产方法主要是化学合成法。由于该法以强酸或强碱为催化剂,反应过程产生大量的污染物,对环境的负面影响极大。利用脂肪酶进行生物柴油的催化合成,能较理想地避免化学合成法中产生的一系列负面效应,真正意义上实现了无污染、可再生的目的,打造了名副其实的“生物柴油”这一环保定义[1,2]。本研究利用固定化脂肪酶催化油酸与甲醇合成生物柴油(油酸甲酯),采用响应面法对工艺条件进行优化,旨在以最优的反应体系实现最大限度的提高转化效率,为脂肪酶催化合成生物柴油提供实验依据。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 固定化脂肪酶:采用硅藻土吸附法制得。
1.1.2 化学试剂:橄榄油(CP,中国医药集团上海化学试剂公司),聚乙烯醇PVA(聚合度1750±50),油酸(AR,汕头市西陇化工厂有限公司),甲醇(AR,天津市永大化学试剂开发中心),95%乙醇、正己烷均为AR。
1.1.3 主要仪器:恒温摇床(Beijing North TZ-Biotech Develop.Co.,SHK-99-Ⅱ)、电热恒温水浴锅(国华企业,THZ-82)、高速组织捣碎机(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司,JJ-2)。
1.2 方法
1.2.1固定化脂肪酶酶活的测定
固定化脂肪酶酶活测定采用橄榄油水解法[3]。一个脂肪酶国际单位(IU)定义为:在pH7.2,38℃的条件下,每1min催化水解橄榄油产生1μmol游离脂肪酸的酶量。对于固定化酶粉以每g酶含有的脂肪酶国际单位数(U/g)表示[4]。
1.2.2 非水相脂肪酶催化合成油酸甲酯的反应体系
在100mL具塞三角瓶中加入一定量的油酸、甲醇及有机溶剂构成的非水相反应体系,加入一定量的固定化脂肪酶,混合均匀,将反应瓶放入恒温摇床中,在一定的温度条件下,以150r/min的速度旋转振荡,并间隔一定的时间加入一定量的3A分子筛以吸收反应过程中产生的水。
1.2.3 油酸甲酯转化率的测定[5]
在恒温摇床中反应一定时间后,取0.5mL样液,加入5mL、95%乙醇终止反应,以1%酚酞为指示剂,用标准氢氧化钠溶液滴定,并按下式计算油酸的转化率:
式中:a为油酸甲酯的转化率;V0为反应初始时样品耗碱体积(mL);V为反应一定时间后样品耗碱体积(mL)。
2结果与分析
2.1 试验设计与结果
通过单因素轮换筛选试验,初步确定影响脂肪酶催化合成生物柴油反应转化率的主要因素有:反应体系中酶添加量、有机溶剂量、底物摩尔比。为了最快、最有效地找到它们的最佳组合,采用响应面法进行优化,实现催化反应的最高转化率。
通过分析,确定采用三因素三水平中心组合旋转设计,以每g油酸所加酶量(X1)、底物物质的量之比(油酸与甲醇的物质的量之比,X2)、正己烷用量(X3 )3个因素为研究对象,考察它们对反应过程中转化率的影响,并对各个因素条件进行了优化。该设计共15个试验,对应的因素和水平见表1,实验设计及结果见表2。结果表明:转化率实测值与拟合值之间的差异非常小,较为吻合,平均拟合误差只有0.23%,实际试验结果得出的转化率较为理想。
2.2 建立二次响应面回归模型
利用SAS统计软件的二次响应面回归(RSREG)进行数据分析,参数值见表3,得到拟合二次回归方程如下:
Y1=94.44+1.22×X1- 0.74×X2-0.95×X3-0.02×X1×X1+0.40×X1×X2+0.13×X1×X3- 1.13×X2×X2-0.30×X2×X3+0.16×X3×X3
拟合二次回归方程建立的模型可信度分析见表4。结果表明:(1)二次响应面回归模型是极显著(决定系数R2=0.97),模型拟合程度较理想,说明这3个因素及其二次项能解释Y变化的97%。(2)由表4可知,线性项P值为0.005、平方项P值为0.0187,说明因素线性及平方项变化对转化率影响较大,而交互项P值为0.2358,反映出因素之间交互不明显。(3)总模型回归P值为0.0027,回归极显著,拟合不足P值为0.66,失拟程度极不显著,因此该模型的拟合程度较高,可用于该催化反应体系优化的理论推测。
2.3 回归方程岭脊分析寻找最佳组合
在获得响应面分析结果以后,为了求得催化反应体系最佳组合,对响应参数进行岭脊分析,得到最大酯化效率的最佳反应体系组合(如表5):X1=0.71 (每g油酸加入0.568g固体酶);X2=—0.06 (油醇摩尔比1∶1.2);X3=—0.70 (2g油酸加入3.3mL正己烷 ),预测值为95.99%,即酯化效率最高时的最佳反应体系组成:每g油酸加入0.568g的固定化脂肪酶及3.3mL的正己烷;油酸与甲醇物质的量之比为1∶1.2。
2.4 回归模型的验证
以岭脊分析得出的最佳反应体系组合进行催化反应试验。分别以分析结果得出的最佳体系组合进行验证试验,预测值与实验结果如表6所示,通过定时测定(如图1)可知,最终转化率达到95.59%,试验值与预测值相差+0.417%,可见该分析方法可以较好地预测实际的转化率情况,说明利用响应面分析法进行实验优化是可行有效的。
3结论
3.1利用响应面法优化获得固定化脂肪酶非水相催化合成油酸甲酯的最佳体系为:在每g油酸加入0.568g的固定化脂肪酶及3.3mL的正己烷,油酸与甲醇摩尔比为1∶1.2。
3.1建立了二次响应面回归方程Y1=94.44+1.22×X1- 0.74×X2-0.95×X3-0.02×X1×X1+0.40×X1×X2+0.13×X1×X3- 1.13×X2×X2-0.30×X2×X3+0.16×X3×X3,可以很好描述体系中酶添加量、有机溶剂量、底物摩尔比的三个因素对转化率的影响。
3.3对响应面分析结果进行验证试验,最终实验转化率达到95.56%,与响应面预测值95.99%的吻合程度较高,说明利用响应面分析法进行优化催化体系是成功的。
参考文献:
[1] 张呈平, 杨建明, 吕剑. 生物柴油的合成和使用进展[J]. 工业催化, 2005, 5 (13) : 9- 13.
[2] 黄小明, 谢文磊, 彭红. 生物柴油的现状和发展[J]. 精细石油化工, 2005, (1): 59- 61.
[3] 陈建平, 崔建兵, 郑毅. 油酸甲酯酶法酯化合成的研究[J]. 福建师范大学学报: 自然科学版, 2008, 24(增刊): 109-112.
[4] 陈建平. 碱性脂肪酶酶活测定的影响因素探讨[J]. 福建师范大学学报:自然科学版, 2001, 17(增刊):24-27.
[5] 邓利, 谭天伟, 王芳. 脂肪酶催化合成生物柴油的研究[J]. 生物工程学报, 2003, 19(1): 97-101.