无菌检查时消除美罗培南的抑菌性
【摘 要】目的：比较消除美罗培南抑菌性的方法，增加美罗培南无菌检测的准确性。方法：分别采用添加酶和增加冲洗次数及加大振荡的方法进行试验比较。结果：美罗培南无菌检查时采用加大振荡和增加冲洗次数的薄膜过滤法可以很好的消除美罗培南的抑菌性。结论：采用人工振荡加冲洗6次的方法可以增加美罗培南无菌检测的准确性，满足药典要求。
【关键词】美罗培南；无菌检查； 抑菌性； 消除
美罗培南为人工合成的广谱碳青霉烯类抗生素，通过抑制细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用[1]。其抗菌谱广，大多数β-内酰胺酶对其无效[2]。而带有抑菌性的药品无菌检验准确与否的关键是试验中对其抑菌性的有效消除，因此美罗培南的抑菌性为目前美罗培南无菌检测中的一个重要问题[3]。
1 试验材料与仪器
1.1 仪器：HTY-K型振荡仪、高得泰林Htysteritest601型集菌仪、KDGB330全封闭式集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）
1.2 菌种：由中国药品鉴定所提供的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26003]；
1.3 青霉素酶（酶活≧300万单位/ml），张家口市格瑞生物化学科技有限公司；
β-内酰胺酶Ⅱ（酶活≧200万单位/支）杭州北望生物技术有限公司。
1.3 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液
1.4样品：美罗培南（批号05001 05002 05003）为石药集团中诺药业生产。
2 方法与结果
2.1 菌液制备与计数 接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养 18～24 小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。 取菌液1ml，置直径 90mm 的无菌平皿中，注入 15～20ml 温度不超过 45℃的溶化的营养琼脂培养基混匀，凝固，倒置培养。30-35℃培养2天。 试验结果记录见表1。
2.2 供试液的制备：取美罗培南3克，将其无菌转移到500ml的0.023%无菌碳酸钠溶液中，摇匀作为供试液。
2.3薄膜过滤
取一次性集菌培养器，先用少量pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜，将上述其中一份供试液按薄膜过滤法平行加入其中的1个滤筒中过滤处理，另2个滤筒中不加供试液直接过滤冲洗液，作为对照筒，每筒每次过滤100ml，边过滤边振荡；过滤完样品后，再用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗3个滤筒的滤膜，边冲洗边振荡，每次每个滤筒平行加入冲洗液100ml，冲洗结束后往滤筒中加入100ml的无菌硫乙醇酸盐流体培养，对照筒中的一筒不加菌液作为阴性对照，另一筒和样品筒分别加入上述2.1中制备好的菌悬液1ml，分别作为样品的阳性对照和抑菌性检查。如果需要加入酶，则酶提前无菌加入到培养基中。将加好培养基和菌液的硫乙醇酸盐流体培养基筒盖好塞后置30-35℃培养3天，每天观察并记录结果。试验结果记录：见表2
3 实验结果
3.1 菌液计数结果
由表1可见，阳性对照菌的菌悬液可选用稀释级别为10-6，每次加入1ml即可满足药典的规定。
3.2 薄膜过滤法结果
3.1 判断标准
3.1.1 阴性对照筒应无菌生长；
3.1.2 与阳性对照筒比较，如含供试品的每个滤筒中的试验菌均生长良好，这说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用获抑菌作用可以忽略不记，可以照此检验方法将供试品的抑菌性消除；如含供试品的任何一个滤筒中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，这说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌性。
3.3 薄膜过滤法试验结果
2. “-”表示无菌生长，“+”表示生长微弱，“++”表示生长良好。
由表2可以看出，本次实验结果有效，并且青霉素酶和头孢菌素酶对消除美罗培南的抑菌作用甚微，增加振荡幅度可以增加美罗培南的溶解性，同时若再增加冲洗次数，可以很好的去除美罗培南在过滤膜上的残留，从而更好的消除美罗培南的抑菌性。
4 讨论
通过试验可以得出在美罗培南的无菌检查时：
4.1 青霉素酶和头孢菌素酶对美罗培南的作用甚微，所以依靠添加酶来消除其抑菌性的方法是行不通的；
4.2 只靠增加冲洗次数来消除抑菌性的办法是不可靠的；
4.3在加大振荡促使其溶解的同时加大冲洗次数以消除抑菌性的方法是有效的。
因此根据试验结果及中国药典规定，在对美罗培南进行无菌检测时，阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌，采用人工振荡加冲洗6次的方法来消除其抑菌性的检查方法是可行的。
参考文献：
[1] 孙心君，李永华，刘星等.常用抗生素药物治疗学（第1版）[M].天津：天津科学技术出版社，2009.100-100.
[2] 杨新云，吴玉新，洪诤等.美罗培南等18种β-内酰胺类抗生素对产酶株的抗菌作用[J].现代临床医学生物工程学杂志，2003，9（6）：491-493，498.
[3] 国家药典委员会，中华人民共和国药典（二部）[S].北京；化学工业出版社，2010，附录Ⅺ H.