几种芽孢杆菌共培养对产蛋白酶的影响
材料与方法
1.1 菌种的活化与培养条件
将实验室保存的枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌的菌种划斜面37℃培养24h。供试菌株均采自荣昌县某零排放养猪场垫料。培养基[3]组成为：1%葡萄糖、0.55%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.2%KH2PO4、1%Na2CO3、0.2%MgSO4·7H2O，调整pH8.0。
1.2 产蛋白酶菌株的配伍
分别选取具有产蛋白酶能力菌株活化12h作为种子液按4%的接种量，两两共发酵或三者共发酵接入装有20ml液体培养基的50ml三角锥瓶中（各菌株等量接种），置37℃160r/min进行摇瓶发酵培养，分别培养至24、48h时取发酵液，测定蛋白酶活性，与菌株单独发酵的蛋白酶活性进行比较。
1.3 蛋白酶活力测定
将培养了24、48h的各菌株发酵液于4℃8000r/min离心10min，取上清液，即为粗酶液。粗酶液蛋白酶活力测定、蛋白酶活力计算方法、酶活力单位的定义均根据文献[6]进行。
1.4 统计分析
对所得结果进行方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 单一菌株发酵蛋白酶活性
将分离、纯化后得到的纯种菌株按4%的接种量接入发酵培养基，进行菌株单独发酵培养，置37℃160r/min摇床振荡培养后，在培养至24、48h时提取粗酶液，测定酶活力。由表1可知，实验室所保存的4种芽孢杆菌发酵液均有蛋白酶活性，发酵24h内4种芽孢杆菌的蛋白酶活性无显著性区别，48h后枯草芽孢杆菌与纳豆芽孢杆菌的蛋白酶活性显著高于地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。
2.2 不同菌株两两共发酵蛋白酶活性
将菌株两两混合进行共发酵培养，测定发酵24、48h的蛋白酶活性。由表2可知，对菌株两两共发酵24h后，枯草芽孢杆菌与纳豆芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活性在0.05水平显著高于其他组合，发酵48h后它们的蛋白酶活性与其他组相比差异在0.01水平显著。
2.3 3种菌株共发酵蛋白酶活性
选取3种纯化后的菌株进行混合发酵培养，置于37℃160r/min摇床振荡培养后，在培养至24、48h时提取粗酶液，测定酶活力。
由表3可知，发酵24、48h的结果差异不显著，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵液与枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的发酵液在0.05水平显著高于纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活性。
表3 3种芽孢杆菌共发酵酶活检测
U/ml
发酵时间h枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌
2413.57±0.7013.32±0.698.86±0.22
4815.40±0.48*14.98±0.60*10.12±0.87
注：表中数据均为平均值±标准差（n=3）；*P<0.05。
3 结论与讨论