蛴螬质量标准的提升研究

材料

1.1药品试剂

硅胶G板、高效硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板（青岛海洋化工厂），merck板（德国默克公司），HSGF254板（烟台芝罘），茚三酮（天津致远化学试剂有限公司），甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸对照品（上海麦克林生化科技有限公司），乙醇、正丁醇、冰醋酸（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.2实验仪器

循环水式多用真空泵（SHB-IIIS，郑州长城科工贸有限公司），Biostep-AS30型半自动点样仪（德国迪赛克公司），CAMAG TLC Visualizer- 2型薄层色谱数码成像系统（德国CAMAG公司），FA1104型電子天平（上海良平仪器仪表有限公司），SB-800 DTD型超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），METTLER TOLEDO-HR83水分测定仪（上海仁沃实业发展有限公司），GZX-9146 MBE数显鼓风干燥器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SX2-4-10箱式电阻炉（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3供试药材

供试药材来源情况见表1。

2方法与结果

2.1薄层鉴别法

2.1.1氨基酸薄层条件的探索

取干燥药材粉末过4号筛，称量1 g置于50 mL三角瓶中，加入10 mL的70%乙醇在20℃，70 Hz下超声提取30 min，滤液作为供试品。吸取供试品溶液2 μL点于G硅胶薄层板上，用四种薄层展开系统：a：正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶1;b：正丁醇∶冰乙酸∶水=8∶3∶1;c：正丁醇∶冰乙酸∶水=6∶3∶1;d：正丁醇∶冰乙酸∶水=5∶4∶1，分别展开8 cm，取出晾干后喷0.2%茚三酮乙醇溶液，然后105℃烘箱烘5 min，显色观察。

最终确定展开系统为正丁醇∶冰乙酸∶水=6∶3∶1，在此系统条件下，可以清晰看见4个点，且无拖尾现象。

2.1.2氨基酸成分的考察与确定

为了鉴别蛴螬薄层色谱中的氨基酸，我们采用20种氨基酸作为对照品以确定其种类。方法：采用20种氨基酸，分别用70%乙醇配制成1 mg/mL的溶液作为对照品。再分别吸取2 μL所制供试样品和20种氨基酸对照品依次点于10 cm×20 cm默克板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水=6∶3∶1为展开剂展开。展开8 cm，取出，晾干，喷以0.2%茚三酮溶液，然后105℃烘箱烘5 min，显色至斑点清晰。

通过Rf值与颜色可以大致确定样品薄层色谱前三点为亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸。由于一些氨基酸Rf值接近，进一步通过不同高效板确定。采用青岛海洋高效G板分别对部分氨基酸进行重复点样展开验证。

综合两次结果比对颜色与Rf值，确定薄层色谱前三点分别是：亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸。

2.1.3供试品溶液制备方法的考察与点样量的考察

供试品溶液1：取药材粉末1 g，加70%乙醇10 mL，超声30 min后取滤液。供试品溶液2：取药材粉末1 g，加70%乙醇10 mL，超声15 min后取滤液。供试品溶液3：取药材粉末1 g，加70%乙醇10 mL，超声45 min后取滤液。供试品溶液4：取药材粉末1 g，加乙醇10 mL，超声30 min后取滤液。供试品溶液5：取药材粉末1 g，加水10 mL，超声30 min后取滤液。供试品溶液6：取药材粉末1 g，加水10 mL，沸水浴回流3h后取滤液。根据薄层色谱法实验，吸取上述供试品2 μL与4 μL，分别点于同一硅胶HSG预制板上。

各点展开差别不大，70%乙醇超声提取30 min，点样2 μL，结果斑点相对分离较完全，清晰。确定供试品点样量2 μL，探索对照品点样量，分别点1 μL（1 mol/mL）对照品，结果亮氨酸显色不明显，将亮氨酸点2 μL，各点清晰。

薄层鉴别（TLC）方法的确定：通过上述实验研究，确定TLC鉴别方法为：取本品粉末1 g，加10 mL70%乙醇超声处理30 min，滤液作为供试品溶液，另取亮氨酸，丙氨酸和缬氨酸对照品，加70%乙醇制成1 mg/mL对照品。吸取供试品溶液2 μL，对照品亮氨酸2 μL，丙氨酸，缬氨酸各1 μL，分别点于同一高效硅胶G板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）为展开剂，展开取出，晾干喷以0.2%茚三酮溶液，加热显色，结果与对照品在相应的位置有相同的斑点。

2.2方法耐用性考察

2.2.1薄层板的考察

吸取供试品溶液2 μL，对照品亮氨酸2 μL，丙氨酸、缬氨酸各1 μL，分别点于来源不同硅胶板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）展开系统展开，取出，晾干后喷以0.2%茚三酮溶液，105℃烘5 min，白光下检视。结果见图6。由图可知四种板都能鉴别，默克板和青岛H板分离效果相对较好。

2.2.2不同温度考察

固定相对湿度为30%，分别吸取供试品溶液2 μL，对照品亮氨酸2 μL，丙氨酸，缬氨酸1 μL，分别点青岛海洋G板上，分别在温度4℃和室温24℃条件下，用正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）展开系统展开，取出，晾干，后喷以0.2%茚三酮溶液，105℃加热5 min，白光下检视。由图可知，在4℃～24℃范围内，温度对其鉴别分离情况未产生明显影响。

2.2.3不同湿度考察

固定温度为24℃，分别吸取供试品溶液2 μL，对照品亮氨酸2 μL，丙氨酸，缬氨酸各1 μL，分别点青岛海洋G板上，分别在18%和72%湿度下条件下，以正丁醇∶冰乙酸∶水（6∶3∶1）为展开系统展开，取出，晾干，再喷以0.2%茚三酮溶液，105℃加热5 min，白光下检视。结果如下图，由图可知这两个湿度条件对其鉴别没有多大的影响。

2.2.4四批蛴螬的氨基酸薄层鉴别

分别取贵州安顺、河北安国、河南信阳、安徽淮北按供试品溶液制备方法制备方法制备样品，按确定的氨基酸薄层定性鉴别条件鉴别，结果如下，四批药材均有亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸。

2.3检查

2.3.1水分检测

采用《中国药典》（2015年版）四部通则0832第二法（烘干法）[16]进行测定，结果显示：四批药材水分范围为7.00%～8.56%。根据测定结果，暂定水分不得超过10.0%，详见表3。

2.3.2总灰分与酸不溶性灰分

按照《中国药典》（2015年版）四部通则2302灰分测定法[16]，对4批样品进行测定，结果见表3。暂定总灰分不得超过33.0%;暂定酸不溶性灰分不得超過13%。

2.3.3重金属检查

采用《中国药典》2015年版四部通则0821重金属检查第二法[16]，取总灰分项下的残渣，对收集到的4批样品进行检查，结果4管显出的颜色都要浅于对照管的颜色。根据检查结果，规定蛴螬含重金属不得过30 ppm。

2.3.4浸出物

根据文献得知，蛴螬的有效成分大部分为水溶性成分或醇溶性成分，故以水和不同浓度乙醇作为浸出溶剂，参考中国药典2015年版四部通则2201[16]，对蛴螬进行浸出物的测定研究。结果见表2。

以上数据表明，蛴螬热浸出物的测定结果要高于对应浓度冷浸出物，且50%热浸条件浸出物最高，同时考虑到水条件下难以过滤，采用50%醇热浸法测定浸出物。

照中国药典中醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，对收集到的4批样品进行浸出物测定。结果4批样品浸出物均值范围为40.3091%～40.7904%，每批RSD范围在0.9%～1.27%（n=3）。暂定蛴螬在50%醇热浸出物不得少于39%。结果见表3。

3结论与讨论

研究报道蛴螬中含有丰富的氨基酸[6]，因此本实验通过分别点样20种氨基酸，比较Rf值和斑点颜色来确立与样品展开的对应的斑点，由于20种氨基酸在70%醇的溶解度各不相同且有些氨基酸Rf值接近，本实验先通过在同一块硅胶上分别点20种2 μL 70%乙醇溶解的氨基酸，先根据与供试品展开斑点的颜色与Rf值来大致确定几种相对应氨基酸，根据第一次结果适调整各种氨基酸点样量和延长展距，再换另一种高效硅胶板展开，最后有效地确定与供试品薄层色谱对应的前三个点由上到下依次为亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸。在检查蛴螬浸出物时，由于蛴螬在不同醇浓度下浸出物浓度差别较大，通过探索比较5个不同醇浓度下冷浸和热浸的浸出比例，在50%醇热浸出物最高，设定在50%醇热浸出物不得少于39%，有效地确定蛴螬浸出物的标准。通过对蛴螬质量标准提升研究，有效控制了蛴螬的质量。

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