基于羟基磷灰石的丹酚酸组分磷脂复合物共沉淀物的制备研究

材料

Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元泵，自动进样器，DAD二极管阵列检测器）， ZRS-8G型智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）；EyeTech-激光粒度粒形分析仪（荷兰安米德Ankersmid有限公司）；DSC204差示扫描量热仪（德国Netzsch公司）；D8型X-射线衍射仪（德国Bruker公司）；470-傅立叶红外光谱仪（美国Nicolet公司）；UV-2450型紫外分光光度仪（日本岛津）。

丹酚酸组分（含量>70%，其组成为10.92%丹参素、50.2%丹酚酸B，西安小草植物科技有限责任公司，批号20121204）；丹酚酸B，丹参素对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为111562-200807，110855-200504）；羟基磷灰石（南京埃普瑞纳米材料有限公司，批号EM110917314，纯度99%，粒径为20 nm）；无水乙醇等试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸指标成分的含量测定

2.1.1 色谱条件 Hedera ODS-2 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水-甲酸（85∶15∶0.1）；流速1.0 mL·min^-1，柱温30 ℃。检测波长281 nm。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取丹参素对照品3.69 mg，丹酚酸B对照品10.04 mg分别置于50 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，得质量浓度为73.80，200.08 mg·L^-1的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液0.5，1.0，2.5，4.0，5.0，7.5 mL至10 mL量瓶中，用70%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进行HPLC测定其对应的峰面积，以质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：丹参素y=5.911 6x+11.828，r=0.999 7；丹酚酸B y = 9.736 3x-63.733，r=0.999 6。结果表明，各指标成分在测定浓度范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液，重复进样6次，测定其峰面积，得丹参素、丹酚酸B的RSD 分别为2.0%，1.4%，表明该方法精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 精密吸取对照品溶液，分别在0，2，4，6，8，12 h进样，测定其峰面积值，得丹参素、丹酚酸B的RSD分别为1.9%，2.2%，表明该对照品溶液在12 h内稳定。

2.1.5 重复性试验 精密称取同一份丹酚酸磷脂复合物及其羟基磷灰石共沉淀物各6份，平行配制一定浓度的6份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，丹酚酸磷脂复合物中丹参素、丹酚酸B的RSD分别为1.2%，1.7%；共沉淀物中丹参素、丹酚酸B的RSD分别为1.6%，1.9%，表明重复性均良好。

2.1.6 回收率试验 精密称取已知含量的丹酚酸磷脂复合物及其羟基磷灰石共沉淀物，制备成供试品溶液6份，分别加入丹参素和丹酚酸B对照品溶液适量，精密吸取混合溶液1 mL，用70%甲醇定容至10 mL，分别进样，测定并计算平均回收率和RSD。丹酚酸磷脂复合物中丹参素、丹酚酸B的平均回收率分别为99.01%，98.87%，RSD分别为1.4%，2.0%；共沉淀物中丹参素、丹酚酸B的平均回收率分别为100.7%，98.49%，RSD分别为1.5%，2.2%。

2.2 丹酚酸磷脂复合物与羟基磷灰石共沉淀物的制备及体外溶出试验

2.2.1 共沉淀物的制备 根据本课题前期实验基础，称取丹酚酸组分100.0 mg和大豆磷脂150.0 mg溶于20.0 mL四氢呋喃中，40 ℃条件下反应3 h后，减压除去反应溶剂，再加入适量的二氯甲烷，充分溶解其中的磷脂及复合物，抽滤，同时滤液再次减压干燥，蒸干即得丹酚酸组分磷脂复合物。称取所制备的丹酚酸组分磷脂复合物适量，加入适量无水乙醇溶解，按复合物与载体质量比为1∶0.5，1∶1，1∶2，1∶3精密称取羟基磷灰石，分散于上述溶液中，充分混匀，40 ℃减压条件下，旋转蒸发除去溶剂，干燥，研磨，过80目筛，即得，置干燥器内保存备用。

2.2.2 溶出度测定 按《中国药典》2010年版二部规定的桨法测定，称取适量丹酚酸磷脂复合物和不同比例的共沉淀物分别装于胶囊中，置于900 mL的适量水中，转速50 r·min^-1，介质温度（37.0±0.5） ℃，分别于5，10，20，30，40，60，90，120 min定时移取溶液5 mL，同时补以等体积等温度释放介质，0.45 μm 微孔滤膜过滤，精密量取10 μL，注入液相色谱仪中，记录峰面积，计算样品浓度，得出对应时间点药物的累积溶出率。

丹酚酸磷脂复合物与羟基磷灰石共沉淀物体外释放曲线见图1，2。不同比例的处方中随着辅料比例增大，药物的溶出逐渐加快，当丹酚酸磷脂复合物与载体比为1∶1时，增加不是十分明显，120 min药物未完全释放；丹酚酸磷脂复合物与载体比例为1∶2或1∶3时，药物溶出较快，120 min已基本释放完全，达到了较理想的释放效果，考虑到载药量的问题，因而选择1∶2的共沉淀物为宜。

2.3 粉体学性质的考察

2.3.1 粒径与粒径分布 将适量样品均匀分散于载玻片上，再将载玻片置于激光粒度分析仪内，测定其粒径及粒径分布。结果见表1，共沉淀物的粒径分布范围较磷脂复合物稍宽，说明其均匀性稍差。

2.3.2 比表面的测定 分别取磷脂复合物及其共沉淀物适量，于60 ℃流通氮气内干燥至恒重，置入比表面积测定仪中，利用BET法测定磷脂复合物及其共沉淀物的比表面积，结果分别为（156.2±4.9），（167.9±8.0） m²·kg^-1，两者对比无显著性差异。

2.3.3 休止角的测定 将漏斗放置于水平放置的平面上，小心地将适量粉末倒入漏斗中，使其通过漏斗自由落在平面上，直到粉末停止流动为止，测出圆锥体的直径和高，根据以下三角函数求出休止角θ，tgθ=2×高/直径。实验测得磷脂复合物及其共沉淀物的休止角分别为（58.9±1.7）°，（37.8±1.1）°，两者对比差异显著（P<0.01）。粉末的休止角是评价流动性的一个重要参数。一般认为粉末的休止角小于30°时流动性较好，大于40°时，则粉末的流动性较差^[5-6]。由结果可知共沉淀物的流动性较磷脂复合物流动性有所提高。

2.3.4 松密度和摇实密度的测定 精密称取一定量粉末，置于10 mL量筒中，准确记录其体积，计算出松密度。后将量筒从距离桌面2 cm处下落，振动10次，准确记录其体积，计算出摇实密度和压缩指数，结果见表2。压缩指数=（摇实密度-松密度）/摇实密度×100%。

结果显示，共沉淀物的压缩指数为15.5%，明显小于磷脂复合物（P<0.01），表明其流动性良好，粒子不需要借助外部能量即可以形成一个密实紧致的状态。可以发现磷脂复合物和共沉淀物相互间的差别主要体现在两者松密度值上，这是由于松密度相对大的粉体由于其自身重力的原因，更容易克服料层粒子间的摩擦力、附着力而产生相互滑移。

2.3.5 吸湿性的测定 按《中国药典》2010年版二部附录药物引湿性试验指导原则进行。取干燥的具塞玻璃称量瓶于前一天置于恒温干燥器[温度（25±1） ℃，下部放置氯化铵或硫酸铵饱和溶液]内，精密称重M1。取粉末适量，置上述称量瓶中并平铺于称量瓶内，精密称重M2。将称量瓶敞口，并与瓶盖同置于上述恒温恒湿条件下24 h。盖好称量瓶盖子，精密称重M3。吸湿性=（M3-M2）/（M2-M1）×100%，磷脂复合物及其共沉淀物结果分别为（15.6±0.9）%，（6.4±0.5）%，两者对比有显著性差异（P<0.01）。磷脂复合物黏性较大，吸湿性强，储备过程中会出现严重的结块现象，而共沉淀物的吸湿性明显降低，有利于下一步制剂的成型。

2.4 微观结构的表征

2.4.1 差示量热扫描分析（DSC） 以空铝钳锅为参比物，另一铝锅中放入适量样品，扫描范围0～400 ℃，升温速率10 ℃·min^-1，分别对羟基磷灰石及其与丹酚酸组分磷脂复合物共沉淀物进行差示扫描量热分析，结果见图3。丹酚酸组分原料药熔融峰较宽，在100，260，330 ℃左右分别出现了较明显的吸热峰；而磷脂复合物在180，270，350 ℃处也存在明显的吸热峰，丹酚酸组分的吸热峰已基本消失，说明药物以无定形状态存在于磷脂分子中；共沉淀物在180，270 ℃左右处出现了吸热峰，未出现丹酚酸组分原料药的结晶特征峰，表明丹酚酸组分原料药仍旧以无定形状态分散于磷脂分子中。

2.4.2 X-射线粉末衍射法分析（XRD） 测试条件为 Cu靶（40 kV，40 mV）；步进扫描0.01°/步；扫描范围5°～70°；扫描速度4 °·min^-1。分别对羟基磷灰石及其与丹酚酸组分磷脂复合物共沉淀物进行X射线粉末衍射分析，结果见图4。丹酚酸组分原料药在0°～40°存在多个结晶特征衍射峰，而丹酚酸组分磷脂复合物衍射图上仅为一宽带，表明药物以无定形状态存在于磷脂分子中；羟基磷灰石在20°～60°也有多个结晶衍射峰存在；共沉淀物的衍射图谱与羟基磷灰石较为相似，未出现丹酚酸组分原料药的结晶特征衍射峰，再次说明在制备共沉淀物的过程中，药物结晶未析出，仍旧以非晶型的形式存在。

2.4.3 红外光谱分析（FTIR） 分别取羟基磷灰石及其与丹酚酸组分磷脂复合物共沉淀物少许，与KBr 在干燥环境下混合制片后，在4 000～400 cm^-1进行红外光谱测定，结果见图5。丹酚酸组分原料药在3 500 cm ^-1处出现的强峰为丹酚酸组分中-OH的特征峰；丹酚酸磷脂复合物在3 500 cm ^-1处出现了-OH的伸缩振动峰，在2 900 cm ^-1处出现了2个脂肪链的C-H的特征峰；羟基磷灰石在3 400 cm ^-1处为结构中-OH的特征峰，1 030，550 cm^-1左右处为PO4³-的特征峰，共沉淀物的红外图谱中未见新的吸收峰出现，说明丹酚酸磷脂复合物与羟基磷灰石之间没有发生相互的化学作用。

3 讨论

中药制剂的研究必然要考虑中药多组分、多成分、多性质的特点，基于组分层次的剂型设计应区别于传统剂型^[7-8]。当单一制剂技术不能满足中药组分的特点时，利用现代多元制剂技术，解决组分生物药剂学性质的复杂性，从而改善其生物利用度。本实验在前期研究基础上，通过固体分散体技术改善丹酚酸组分磷脂复合物的性质缺陷，制备合适的剂型，提高其生物利用度。

羟基磷灰石具有较大的比表面积，吸附药物量大，具有良好的生物相容性和生物活性，安全性较好^[9-10]，因而选择其作为丹酚酸组分磷脂复合物载体，制备共沉淀物。由于磷脂的疏水性使得丹酚酸组分体外溶出有所降低，而羟基磷灰石提高了磷脂复合物的润湿性，磷脂复合物可能吸附在其表面形成共沉淀物，有效的提高了药物的体外溶出，达到了理想的溶出效果，同时经DSC，XRD和FTIR 3种方法综合分析可知固体分散体技术没有破坏药物的晶型，药物仍旧以非晶型的形式存在。粉体学性质的考察结果显示所制备的共沉淀物流动性良好，吸湿性低，粉体学性质得到了较大的改善，能够满足制剂需要，为制备丹酚酸组分释药单元提供了基础。

本实验所制备的丹酚酸组分磷脂复合物羟基磷灰石共沉淀物体外溶出效果良好，制备工艺简单可行，为丹酚酸组分的制剂学研究提供了参考。

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Studies on hydroxyapatite applicatied in coprecipitate of total

salvianolic acids phospholipid complex

CHEN Xiao-yun 2， ZHANG Zhen-hai LIU Dan SUN E JIA Xiao-bin 2*

（1. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica， Jiangsu Provincial Academy of

Chinese Medicine， Nanjing 210028， China；

2. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] The purpose of this research was to prepare total salvianolic acids-phytosome-HA coprecipitate to improve drug dissolution and its micromeritic properties. Firstly， the coprecipitate was prepared by solvent method and in vitro dissolution of tripterine was performed with the salvianolic acid B and danshensu as criteria.At the same time， the micromeritic properties was characterizated， the structure of samples was characterized by TEM，DSC，XRD and FTIR.Results showed that when the ratio of drug to HA was 1∶2， it had a better dissolution， the accumulative drug-release percent in vitro at 60 min was over 90%. At the same time， it has good liquidityand low moisture absorption.Its micromeritic properties have improved. It is proved that the drug still existed amorphously by microstructure analysis. The preparation process is simple and feasible，it has practical value.

[Key words] total salvianolic acids phospholipid complex； hydroxyapatite； coprecipitate； micromeritic properties

doi：10.4268/cjcmm20140607

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