多穗柯转录组分析及黄酮类化合物合成相关基因的挖掘
材料与方法
1.1 cDNA制备
以多穗柯嫩叶为本研究原材料提取植物总RNA，再逆转录为cDNA，用于构建转录组数据库。植物总RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 转录组数据的组装与分析
1.2.1 组装 采用Illumina HiSeq 4000测序技术平台的PE150技术进行测序，将得到的Raw Data进行过滤处理，获得高质量的Clean Reads，使用trinity软件进行组装，得到Unigene。
1.2.2 功能预测 利用BlastX将All-Unigene与[7]，Swiss-Prot[8]，GO[9]，KOG[10]，KEGG[11]等6个数据库进行比对。又使用KOBAS2.0[12]去获取序列在KEGG中比对KEGG Orthology结果，预测出序列的氨基酸序列之后，使用HMMER[13]软件与Pfam[14]数据库比对，获得注释信息。
1.2.3 黄酮类化合物合成相关基因的挖掘 根据康亚兰[15]和郭欣慰[16]提出的黄酮类化合物合成途径中的结构基因与调节基因，以及KEGG注释的结果和数据库中已知的基因信息，利用本地Blast進行检索比对，确定本转录组数据中与黄酮合成相关的基因。
1.2.4 SSR分析 微卫星序列（microsatellite DNA）又称为简单序列重复（simple sequence repeats，SSR） 或简单序列（simple sequences），是指以1～6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列，其长度大多在 100 bp 以内。它们广泛存在于各类真核生物基因组中，原核生物基因组中也含有少量的微卫星序列[17]。SSR作为分子标记的一种，被广发用于杂交育种、种群遗传多样性、遗传连锁图谱的构建等研究领域。目前关于多穗柯的分子标记十分有限，本研究利用MicroSatallite（MISA）软件找出全部的SSR，为多穗柯的遗传标记研究提供非常重要物质资源和依据。
2 结果与分析
2.1 组装
总共得到6 Gb的Clean Date，组装获得Unigene 41 043条，N50长度为1 472 bp，长度大于N50的Unigene 有8 977条，组装完整性较高，具体组装结果见表1。
通过BlastX与数据库进行比对，有28 970 条Unigene获得注释，从匹配的物种来源分析，有10.91%的Unigene注释到葡萄中，8.51%注释到可可中，其余分别为梅花8.19%、桃6.51%、白僵菌5.38%、麻风树4.85%、桑树4.24%、蓖麻4.12%、野草莓4.05%，橙子3.39%，其余39.85%注释到其他物种中，见图1。
随后将所有的Unigene比对到KOG数据库中，结果显示有15 957条序列获得17 067个注释信息，划分为25个功能分类。从基因功能分布特征中可以发现一般功能预测基因分布最多，多达3 751条，涉及翻译后修饰、蛋白翻转、分子伴侣功能的基因次之，有1 736条，而涉及核结构、胞外结构和细胞运动的基因很少，仅有59条、56条和5条。此物种的KOG功能注释分布结构与其他物种不尽相同，见图2。
A.RNA加工和修饰；B.染色体结构和动力学；C.能源产生和转化；D.细胞周期调控，细胞分裂，染色体分离；E.氨基酸转运和代谢；F.核算转运和代谢；G.碳水化合物转运和代谢；H.辅酶转运和代谢；I.脂类转运和代谢；J.翻译，核糖体结构和生源；K.转录；L.复制，重组，修饰；M.细胞壁，细胞膜，被膜生源；N.细胞活性；O.翻译后修饰，蛋白反转，伴侣；P.无机离子；Q.次生代谢物的生物合成，转运和代谢；R.一般功能预测；S.未知功能；T.信号传递机制；U.细胞内运输，分泌和囊泡转运；V.防御机制；W.细胞外结果；Y.核结构；Z细胞骨架。
通过使用Blast2GO与GO数据库的比对，21 777条Unigene获注释信息，在利用WEGO对注释信息进行分类统计，得到136 004个GO功能注释。由分类结果可知：生物学过程最多60 216条，占44.27%，其次是细胞组分，49 219条，占36.19%，最后是分子功能，26 569条，占19.54%。这三大功能分类又可分为51个亚类，其中生物学过程19个亚类，细胞组分15个亚类，分子功能17个亚类。生物学过程中，涉及代谢过程、细胞过程和单一有机体进程的Unigene较多，分别有14 761，12 924，10 871条；细胞组分中涉及较多的是细胞、细胞部分和膜类，分别有10 018，9 976，8 784条；分子功能中涉及较多的有催化活性和结合功能，分别有11 902，10 544条。与其他物种的表达丰度基本一致。具体种类和数量见图3。
将Unigene 与KEGG比对，进行Pathway注释，获得基因产物在细胞的代谢途径以及这些基因产物的功能。比对结果显示有9 648条序列得到9 325个注释，共涉及到237个KEGG标准代谢通路。按基因获得注释量的多少进行排序，选取前10个见表3，涉及碳代谢的Unigene数量最多有392条，占4.20%，其次是与氨基酸的生物合成相关的Unigene，有343条，占3.68%，其余主要富集于核糖体、嘌呤代谢、糖酵解和糖异生等代谢途径。
通过在数据库中查找已有的基因信息和本地Blast比对，共找出黄酮合成相关基因28条，结构基因21条，调节基因7条，见表4。根据苹果[3]中根皮苷的合成途径可知，苯丙氨酸经过苯丙氨酸解氨酶（47968_c1_g1）、肉桂酸羟化酶（46682_c0_g1）、4香豆酰CoA连接酶（42305_c0_g1）的催化，生成香豆酰CoA；乙酰CoA被乙酰CoA羧化酶羧化而成丙二酸单酰CoA。二者经查耳酮合成酶（43222_c0_g1）催化缩合而成查耳酮，紧接着被糖基转移酶（38697_c0_g1）糖基化而成根皮苷。
本研究利用MicroSatallite（MISA）软件找出全部的SSR，总计18 161个，其中单碱基型重复最为丰富，有7 346个，占总量40.45%，在这之中A/T类型分布占其96.31%。其次是双碱基型重复，6 618个，占总量36.44%，其中AG/CT类型分布占其总量78.57%。其他类型依次为：三碱基型重复，3 843个，占21.16%；四碱基型重复，191个，占1.05%；五碱基型重复，66个，占0.36%；最后是六碱基型重复，97个，占0.53%，见图4。通过对多穗柯SSR的研究，将为多穗柯的遗传标记研究提供非常重要物质资源和依据。
3 讨论
近年来，随着多穗柯的甜味和保健作用，尤其是降糖作用被发现，市场需求逐渐变大，研究工作也不断的深入。为更好地探索多穗柯中黄酮类化合物合成，本研究采用RNA-seq技术，获得6 Gb多穗柯转录组数据，经过拼接组装得到41 043条Unigene，N50的长度为1 472 bp，相对于其他已测序的物种，如油松的N50是744 bp[18]；芝麻的是1 006 bp[19]，组装效果好，完整性高。
通過与7个数据库比对，总共有30 223条Unigene获得注释信息。根据KEGG pathway分析和已知的基因信息，找出28条黄酮合成相关基因，不仅有CHS（查耳酮合成酶）、CHI（查耳酮异构酶）、IFS（异黄酮合成酶）等关键酶基因，还有一些比较重要的基因，如PAL（苯丙氨酸解氨酶）基因、AAC（乙酰辅酶A羧化酶）基因、ANS（花青素苷合成酶）基因，与草麻黄[20]转录组中发现的黄酮合成相关基因大部分一致。通过转录组的组装分析以及黄酮合成相关基因的挖掘，为后续对多穗柯的研究奠定了基础。
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