PRRSV青海株与其他疫苗株对Marc—145细胞的毒力比较

t�E�1��׎Lj�5��V���"http://www.xcysycw.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1 细胞与毒株

Marc145细胞来源于中国兽医药品监察所菌种保藏中心；PRRSV青海株由

家畜疫病病原生物学国家重点实验室分离并鉴定；CH1R弱毒疫苗株分别购于上海海利生物技术股份有限公司和浙江诺倍威生物技术有限公司；GWHR株由家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存。

1.2 主要试剂

DMEM（高糖）培养基，购自GIBCO公司；胎牛血清，购自PAA公司；胰蛋白酶（含EDTA），购自Bostar公司；1×PBS，购自Sigma公司；台盼蓝，购自Amresco公司；青链霉素双抗，购自Hyclone公司；25 cm2细胞培养瓶、六孔和96孔细胞培养板，购自Corning公司；FITC标记的PRRSV N蛋白的单抗SR30F，购自Rural technologies，Inc（RTI）公司；多聚甲醛，购自Alorich公司。

1.3 Marc145细胞的传代培养

将试验用的1XPBS 和含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基置于37 ℃水浴锅中预热。选取健康的细胞进行传代培养；弃掉细胞瓶中的培养基，用1×PBS（0.01 mol/L，pH为7.2）清洗1～2次，然后加入Bostar胰酶进行消化，在37 ℃温箱消化4 min左右，观察发现当细胞出现圆缩并且彼此分离的现象时，说明细胞已经消化完全；弃掉消化液，加入5 ml左右含10%FBS和1%双抗的DMEM培养基，轻轻吹打细胞后，用移液枪吸出少量细胞悬液，用台盼蓝染色后进行细胞计数；最后，根据计数的结果将细胞用新鲜的含10%FBS和1%双抗的DMEM稀释成1×106个/ml的密度，分装于25 cm2细胞培养瓶中，每瓶10 ml，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.4 PRRSV 的增殖

传代培养的Marc145细胞，细胞生长密度达到80%左右可进行接毒试验。PRRSV青海株为细胞毒，常温融化后可直接进行接毒；CH1R株用疫苗伴侣溶液融化后接毒。弃去细胞瓶中的培养基，用1×PBS清洗2次（目的是洗去细胞瓶中的血清，避免血清对接毒试验造成影响）；根据TCID50计算的细胞毒价，各组分别按照MOI=0.5、1.0、1.5和2.0的接毒量接毒，将接毒后的细胞放入37 ℃ 5% CO2恒温培养箱中孵育1 h（使病毒与细胞充分接触）；然后弃去细胞瓶中PRRSV毒液，再加10 ml左右含5%PAA血清的DMEM，37 ℃ 5% CO2恒温培养箱中孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE达到80%时收获病毒。将细胞瓶放入-80 ℃，反复冻融3次后，2 000 g 4 ℃离心30 min，取上清，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装后-80 ℃保存备用。

1.5 病毒滴度的测定

采用TCID50方法测定病毒滴度，具体步骤如下：①铺板，将在 25 cm2细胞培养瓶中长成单层的Marc145 细胞，弃去培养液，用预温的PBS冲洗2遍，随后加入适量胰酶消化液，37 ℃培养箱消化4 min左右即可；调整消化好的 Marc145 细胞密度为 1×105个/ml，用八孔排枪加入到96孔细胞培养板中，每孔200 μl，置于5%CO2的37 ℃培养箱中培养。②大约24 h后细胞长成单层，小心吸出细胞培养液，并用1×PBS清洗96孔板中的细胞2遍，用不含血清的DMEM培养基将PRRSV病毒液进行连续10倍的稀释，稀释梯度为10-10～100。③将稀释好的病毒液加入到 Marc145 单层细胞孔内，每个稀释度接种8孔（一纵排），每孔接种病毒液100 μl，用正常不接毒的细胞作对照。5%CO2的37 ℃培养箱吸附1 h后，加入细胞维持液（5%胎牛血清的DMEM），100 μl/孔，5%CO2的37 ℃培养箱继续培养。④每隔24 h观察1次，一般需要观察5～7 d。⑤根据CPE出现的情况，采用ReedMuench法计算病毒TCID50。

2 结果与分析

2.1 Marc145细胞培养不同时间段的形态观察

Marc145细胞按照1×106个/ml的密度传代分装于25 cm2细胞培养瓶中后，约48 h生长密度达到100%，可再次进行传代，所以采集了3个不同时间点的细胞形态（图1）。

2.2 PRRSV不同毒株各代次的TCID50值

4株PRRSV体外传代各代次logTCID50值，青海PRRSV传代毒F1～F10代logTCID50值范围为10-9.25～10-4.75个/ml；GWHR株F1～F10代logTCID50值范围为10-9.2～10-4.7个/ml；海利CH1R F1～F10代logTCID50值范围為10-8.8～10-4.25个/ml，诺倍威CH1R F1～F10代logTCID50值范围为10-7.6～10-3.35个/ml；应用Graphpad软件对试验数据进行分析。从图2可以看出，QH08株的TCID50在F4代和F5代之间有显著增加（P<0.005），到F8代时达到最高毒价10-9.25个/ml，F9代和F10代已经趋于稳定。图3是QH08株的F1代到F10每一代都与GWHR株、HILE株和诺倍威毒株同时比较得出的结果。与GWHR株相比，F2代F8代都有显著性差异，只有F1代、F9代和F10代没有，说明QH08株在F2～F8代的TCID50值显著高于GWHR株。与HILE株和诺倍威株相比，F1～F10每一代的TCID50值都有显著性差异，并且P值都小于0.000 1，说明QH08株的毒力明显高于HILE和诺倍威毒株。这说明QH08株的毒力随着体外传代的增加而增加，说明毒株逐渐适应Marc145细胞的生长环境，但是病毒毒力的增加是有限度的，在F8代已趋于稳定。通过与其他毒株的比较，发现QH08株每一代的毒力都明显高于HILE和诺倍威CH1R株，F2～F8代高于GWHR株，说明QH08株的毒力最强。

2.3 不同毒株各代次CPE出现的时间

共选取了4株PRRSV，4株毒株分别在Marc145细胞上传了10代，分别观察CPE出现的时间。由表2可知，QH08株和GWHR F1～F4代CPE出现的时间主要集中在35 h左右，而伴随着毒株代次的增加，传代毒株在Marc145细胞上CPE出现的时间提前，F10代出现CPE的时间已经稳定在26 h左右。从F1代到F10代，病毒在细胞上出现CPE的时间缩短10 h，即毒株逐渐适应了Marc145细胞上的生长环境。海利CH1R株F1～F4代CPE出现的时间主要集中在43 h左右，到F10代CPE出现的时间稳定在31 h，F1代到F10代CPE出现的时间提前了14 h左右。诺倍威CH1R株F1～F4代CPE出现的时间主要集中在50 h左右，F5～F10代的CPE时间稳定在42 h左右，随着毒株体外传代代次的增加，CPE出现的时间提前了12 h左右。与QH08株和GWHR株相比，从F1代到F10代海利CH1R株CPE出现的时间提前了14 h，诺倍威CH1R株CPE出现的时间提前了12 h，QH08株和GWHR株在细胞上出现CPE的时间只缩短了10 h左右，说明海利和诺倍威CH1R对Marc145细胞的适应性比QH08株和GWHR株强，原因可能是海利和诺倍威CH1R都是弱毒疫苗，弱毒疫苗的生产都是经过在Marc145细胞上多次传代制备的，所以海利和诺倍威CH1R株对细胞的适应性更强。从F1代到F10代，QH08株在细胞上CPE出现的时间都是最早的，说明QH08株对Marc145细胞的致病性比其他3株都强。

3 讨论

高致病性PRRS现在仍然是对我国养猪业造成严重危害的头号疫病，目前疫苗接种是对该病预防和控制的最有效方法[18]。笔者选用的CH1R株就是由PRRSV通过连续性传代致弱获得的弱毒疫苗，PRRSV感染Marc145细胞后细胞形态发生变化，细胞变圆，细胞之间有间隙。不同毒株在Marc145细胞上所引起的细胞病变也有明显区别，如接种青海毒株和GWHR的Marc145细胞中病变的细胞聚集呈丛状，而诺倍威引起的细胞病变多是均匀的拉网式。此外，随着PRRSV在Marc145细胞上传代代次的增加，病毒对细胞的适应性逐渐增强，且增殖速率加快，CPE出现的时间提前（F10代较F1代约提前了9 h）。海利CH1R弱毒疫苗株从F1代到F10代CPE出现的时间提前了14 h左右，诺倍威CH1R弱毒疫苗株CPE出现的时间提前了12 h，QH08株和GWHR株在细胞上出现CPE的时间只缩短了10 h左右，CPE出现时间的提前说明病毒对细胞的适应性逐渐增强，且增殖速率加快。因为海利和诺倍威CH1R株从F1代到F10代CPE出现的时间缩短了14 h，而QH08株只缩短了10 h，这说明海利CH1R弱毒疫苗株和诺倍威CH1R弱毒疫苗株对Marc145细胞的适应性比QH08株和GWHR株强，原因可能是海利和诺倍威CH1R都是弱毒疫苗，弱毒疫苗都是Marc145细胞经过多次传代制备而成的，所以海利和诺倍威CH1R株对细胞的适应性更强。但是，从F1代到F10代，QH08株在细胞上CPE出现的时间都是最早的，说明QH08株对Marc145细胞的致病性比其他3株都强。

在TCID50试验中，通过多组培养比对，去掉差异显著值后取均值判断，不同PRRSV株传代毒F1～F10代TCID50 值的总趋势为渐变上调的趋势，间接表明 PRRSV随着代次的增加，在相同时间、相同条件下培养的 Marc145细胞中复制能力增强。QH08毒株及其体外传代毒株的TCID50在F4代和F5代之间有显著增加（P<0.005），当体外传至F8代时达到最高毒价（10-9.25个/ml），F9代和F10代已经趋于稳定。与GWHR株相比，F2代到F8代都存在显著差异，只有F1代、F9代和F10代没有明显差异，说明QH08株从F2到F8代的TCID50值显著高于GWHR株。与HILE株和诺倍威株相比，从F1代到F10代每一代的TCID50值都存在显著差异，并且P值都小于0.000 1，说明QH08株的毒力明显高于HILE和诺倍威毒株。这说明QH08株的毒力随着体外传代代次的增加而增加，说明毒株逐渐适应在Marc145细胞的生长环境，但是病毒毒力的增加是有限度的，在F8代时已趋于稳定。通过与其他毒株的比较，发现QH08株的毒力每一代都明显高于HILE和诺倍威CH1R株，F2～F8代高于GWHR株，说明QH08株的毒力最强。

PRRSV的感染具有阶段性，一般感染后CPE出现的时间和初始病毒感染量（MOI值为0.5～2.0）的关系不大，出现CPE的时间与病毒复制周期的缩短和释放时间的减少有关。PRRSV从F1代到F10代CPE首先出现的时间呈现逐渐缩短到的趋势，说明随着PRRSV毒株代次的增加，病毒在 Marc145 细胞上复制周期也在逐渐缩短。PRRSV不同毒株F10代较F1代的复制周期都缩短了12 h左右，表明PRRSV不同毒株F10代都比F1代在Marc145 细胞中的复制能力更强。此外，与海利和诺倍威CH1R相比，QH08株F1～F10代传代毒株CPE出現的时间都是最早的，QH08株在Marc145细胞上传到F10代时，CPE出现的时间稳定在26 h左右，这表明与其他3个毒株相比，PRRSV青海株在Marc145细胞中的复制能力更强，对细胞的适应性较强，增殖速率较快，在致病力和毒力方面也较强。

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