单分子荧光共振能量转移用于生物大分子构象动态变化过程研究进展

摘 要 生物大分子参与生命活动的各个过程，在单分子水平上实时观测和分析生物大分子自身的结构动态以及生物大分子相互作用的动态过程，对于深入理解生物大分子的作用机制具有重要意义。自提出以来，单分子荧光共振能量转移技术逐渐展现出其在研究生物大分子构象变化和相互作用过程等方面的巨大潜力，一系列新的作用机理陆续被提出。本文对单分子荧光共振能量转移技术在蛋白质与核酸分子构象动态变化、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-核酸相互作用等方面取得的研究进展进行了综述。

关键词 单分子荧光共振能量转移； 生物大分子； 构象动态； 相互作用； 评述

1 引 言

细胞生命活动各个过程都离不开蛋白质、核酸等生物大分子。研究生物大分子的作用机制对于理解基本生物学过程至关重要，然而普通的生物学研究手段无法实时观测生物大分子发挥作用时的状态变化，只能间接地观测宏观现象，然后对过程机制进行推断。依据宏观现象推出的作用机理只能在一定程度上帮助人们认识生物过程，生物分子究竟如何发挥作用，必须有微观的证据才更有说服力，例如ATP合成酶的作用机制、G蛋白偶联受体如何传递信号等，都是在取得单分子水平上的证据后才得到更加深入的认识[1～3]。对于宏观系综研究， 单分子研究的最大优势是可以直接观测到单个生物分子发挥作用时的构象动态或生物分子间相互作用时分子间距离的变化[4～8]，获取的机制更加接近真实情况。此外，单分子水平的研究能夠揭示生物分子之间的个体差异[9]，有助于全面深入地认识生物分子的功能性质。

目前，在单分子水平研究生物分子构象变化或生物分子相互作用动态过程的技术有光镊[10]、 磁镊[11，12]、原子力显微镜[13～16]及单分子荧光技术[17～21]。光镊和磁镊技术要求高，操作难度大，无法进行高通量研究；原子力显微镜的成像时间分辨率低，因此在单分子研究方面应用不多。单分子荧光技术起源于20世纪90年代[17]，目前已经逐渐成熟地被用于生物学领域，并出现多个分支，其中单分子荧光共振能量转移技术（SM-FRET）被广泛用于生物分子相互作用的研究[22]。单分子荧光共振能量转移技术是指能够观测单个生物分子上荧光供体和受体之间共振能量转移的技术[23]，具有以下优势：（1）荧光共振能量转移的原理使其能够观测到生物大分子发挥功能时不同结构域或亚基之间空间位置的变化，或者分子之间相对距离的变化[23]，这些变化对于直接理解生物分子的作用机制十分重要； （2）目前全内反射荧光显微镜广泛应用于SM-FRET研究，其利用激光全反射产生的隐逝波进行照明，具有极高的信噪比，能够观测到界面上单个荧光分子；同时利用高速的制冷型电荷耦合器件（CCD）进行成像，时间分辨率可以达到亚毫秒水平。该高时间分辨率对于实时观测快速的相互作用或构象变化过程至关重要[24]； （3）光学成像允许同时对多个目标进行观测，高通量观测便于比对被研究对象个体之间的差异； （4）成熟的基因工程技术和化学修饰方法使得研究者能够对蛋白质或核酸分子进行定点荧光标记[25～28]，同时，丰富的界面封闭和目标物固定方法可以保证观测的特异性[23]。自1996年，基于SM-FRET技术的研究取得了一系列成果[29]。本文将围绕单分子荧光共振能量转移技术在蛋白分子自身构象动态变化[30～38]、蛋白质-蛋白质动态相互作用[6，7，39]、核酸分子自身构象动态变化[40～47]以及蛋白质-核酸动态相互作用[48～62]等方面取得的一些代表性研究成果进行综述。

2 单分子荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移现象是供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的激发光谱相重叠，且两个分子间距离小于10 nm时，供体的激发能诱发受体发出荧光，同时供体自身的荧光强度减弱的现象，在生物学研究中常被用于鉴定两种蛋白质之间是否发生相互作用。SM-FRET技术是观测单个生物分子上荧光供体和受体之间共振能量转移。目前，SM-FRET实验中最常用的成像仪器是全内反射荧光显微镜（TIRFM），包括棱镜型和物镜型两类（图1A）[63]。商业化的TIRFM多为物镜型，这是因为物镜型TIRFM激发光和荧光都经过物镜，样品台有更大的操作空间，能够更好的与其它设备联用，如显微操作设备。除了设备，SM-FRET实验最关键的是研究对象的定点荧光标记以及对象在界面上的特异性固定。核酸定点标记比较容易，蛋白定点标记则要依赖基因工程手段，还要保证标记的位点不影响蛋白结构。将研究对象特异性地固定在石英片或盖玻片表面，对于观测实验十分重要，目前常用的方式是用聚乙二醇（PEG）封闭玻璃表面，然后通过抗体或生物素-亲和素进行固定（图1B）[63]。SM-FRET实验中获得的数据是荧光供体和受体分子荧光强度随时间的变化的轨迹，然后通过表观FRET效率方程计算出对应的FRET效率随时间变化的轨迹（图1C）[63]，进而对FRET效率进行统计分析，以获得变化规律。

3 单分子荧光共振能量转移技术用于生物大分子构象和相互作用动态研究

3.1 单分子荧光共振能量转移技术研究蛋白分子构象动态

蛋白质分子的折叠和构象动态变化直接关系到其自身功能，研究蛋白质折叠过程和构象动态变化，有助于理解蛋白分子形成功能结构及发挥功能的机理。1999年，Ha等[30]首次将SM-FRET应用于单个葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease，SNase）分子的结构动态研究。他们将荧光供体（Tetramethylrhodamine，TMR）和荧光受体（Cy5）修饰到SNase的两个特定位点上，通过观测分析单个SNase上TMR和Cy5的荧光共振能量转移效率，发现SNase分子之间存在不同的构象波动模式，这归因于蛋白骨架结构或侧链在毫秒级时间范围内的波动。同时，他们通过观测分子间的荧光共振能量转移获得了SNase与单个底物DNA分子之间的动态相互作用信息。该研究为后续研究单个蛋白分子结构动态以及蛋白折叠提供了新思路。

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