紫外线处理对新疆哈密瓜贮藏中几种酶活性的影响
摘要[目的]分析紫外线处理对新疆哈密瓜贮藏中几种酶活性的影响。[方法]利用紫外线处理哈密瓜，测定贮藏期间哈密瓜的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和超氧化物歧化酶（SOD）等指标，得出最佳的紫外线处理条件。 [结果] 哈密瓜紫外线处理及处理后贮藏过程中色泽、风味、营养成分变化与POD、PPO、LOX、PAL及SOD 5种关键酶活密切相关。 [结论]紫外线处理哈密瓜50 min，对延缓果实后熟衰老效果最为明显，可为哈密瓜的贮藏保鲜提供新的科学依据。
关键词哈密瓜；紫外线；酶活性；贮藏效果
中图分类号TS201.3文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0156-03
The Influence of Ultraviolet Treatment on the Enzyme Activity of Hami Melon from Xinjiang during Storage
WANG Jing，ZHANG Zhenghong，LI Hongmin et al
（Supervision and Testing Center for Food Quality Ministry of Agriculture， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science， Shihezi ， Xinjiang 832000 ）
Abstract[Objective]To analyze the influence of ultraviolet treatment on the enzyme activity of Hami melon during storage. [Method]The activity of peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO）， lipoxygenase（LOX）， phenylalanine ammonialyase（PAL） and superoxide dismutase（SOD） of Hami melon were determined during the storage by treatment with ultraviolet. And the best ultraviolet treatment condition was obtained. [Result]The changes of color， flavor and nutrient components of Hami melon are closely related to the activities of POD， PPO， LOX， PAL and SOD after ultraviolet treatment. [Conclusion]The effect of delaying ripe and senescence of Hami melon fruit was most obvious after 50 min treatment. The study was provided a new basis processing for the preservation of Hami melon.
Key wordsHami melon；Ultraviolet radiations；Enzyme activity；Store effect
哈密瓜属一个甜瓜品种，为新疆的名优特产[1]，富含人体所需的多种物质，香甜多汁，风味独特，受到人们的青睐[2]。哈密瓜多以鲜食为主，在其贮藏、加工和运输过程中常面临酶促褐变、变味等问题[3-5]，加之哈密瓜水分含量高、糖度大，不宜长期贮藏[6]。在贮藏过程中，哈密瓜的变质主要由微生物和酶作用引起，因此，杀菌是哈密瓜贮藏保鲜的重要手段之一[7]。紫外线杀菌技术为非热杀菌技术，将其应用于哈密瓜保鲜，就必须系统地研究其对哈密瓜内源酶及其品质的影响，但目前关于紫外线杀菌对哈密瓜酶活的影响还鲜见报道。因此，笔者探讨了紫外线处理对新疆哈密瓜贮藏过程中几种酶活的影响，以期为哈密瓜的贮藏保鲜提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料与试剂。哈密瓜为新疆“8501”品种，八成熟，采摘后预冷，去除田间热后运回实验室。主要试剂：脂肪氧化酶 ，美国Fluka公司；亚油酸，美国sigma公司；L-苯丙氨酸，天津化学试剂公司；其他试验药品与试剂均为分析纯；分析用水均为去离子水。
1.1.2主要仪器及设备。冷冻离心机（15R），力康发展有限公司；超声波清洗器（KQ-250B），舒美仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1240），日本岛津公司；电子天平（DL203），上海精密科学仪器有限公司；恒温水槽（DK8B），上海精密试验设备有限公司；恒温数显水箱（HH42），国华电器有限公司；恒温水浴锅（XMT-DA），亚星仪器仪表有限公司；制冰机（KC55），KATSUNO；冷柜（SCD218），科龙电器。
1.2方法
1.2.1哈密瓜预处理及贮藏。
选取完好哈密瓜120个，洗净晾干，分成4组，每组30个。其中3组利用紫外线分别处理30、50、70 min，设置1组为对照。处理完置于冷藏库内，温度6～8 ℃，相对湿度80%～90%，每隔7 d取样测定各项指标。
1.2.2酶活性测定方法。
1.2.2.1过氧化物酶（POD）活性测定。
①提取缓冲液的配制[8]：称取340 mg PEG 6000、4 g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸緩冲液溶解、稀释至100 mL。②酶液的制备：取5.00 g哈密瓜样品、5.00 mL提取缓冲液，冰浴条件下研磨成浆，在12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，收集上清液，冷藏备用。
③酶活性测定：取3.00 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液和0.50 mL酶提取液，混匀再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液，迅速混匀并计时。测定波长470 nm处的吸光值，以反应15 s时记为初始值，随后每隔1 min 测定1次，重复3遍，以蒸馏水作为参比，下同。酶活计算公式如下：
POD活性（U）=ΔOD470×VΔt×Vs×W
式中，ΔOD470为吸光度变化值；Δt 为酶促反应时间（min）；V 为样品提取液总体积（mL）；Vs为所取样品提取液体积（mL）；W 为样品重量（g）。
1.2.2.2多酚氧化酶（PPO）活性测定。
①提取缓冲液的配制：同“1.2.2.1①”所述步骤。②酶液的制备：取0.50 g哈密瓜样品于研钵中，加入5.00 mL磷酸缓冲液（0.05 mol/L、pH6.8），冰浴条件下研磨成浆，在12 000 r/min、2 ℃条件下离心30 min，收集上清液，冷藏备用。
③酶活性测定：试管中加入4.00 mL的醋酸缓冲液（50 mmol/L、pH 5.5）和1.00 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，随后加入100 μL的酶提取液，开始计时。测定波长420 nm处吸光值，以反应15 s时记为初始值，随后每隔1 min测定1次，重复3遍。酶活计算公式同“1.2.2.1③”，取△OD420进行计算。
1.2.2.3脂氧合酶（LOX）活性测定。
① LOX抽提缓冲液的配制：取1.00 mL Triton X100和4.00 g PVPP，加入到100 mL100 mmol/L、pH 6.8磷酸钠缓冲液中，摇匀，置于4 ℃冰箱预冷。
②酶液的制备：取3.00 g哈密瓜样品、3.00 mL LOX抽提缓冲液，混匀，在冰浴条件下研磨成浆，在12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，收集上清液，冷藏备用。③酶活性测定：取2.75 mL 100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液，加入50 μL 100 mmol/L亚油酸钠，30 ℃保温10 min，加入200 μL粗酶液，混匀。测定234 nm处吸光值，以反应15 s时记为初始值，然后每隔30 s测定1次，共测定3 min，重复3遍。酶活计算公式如下：
LOX活性（U）=ΔOD234×V0.01×Δt×Vs×W
式中，△OD234为测定液的吸光度变化值；△t 为酶促反应时间（min）；V为样品提取液总体积（mL）；Vs为所取样品提取液体积（mL）；W为样品重量（g）。
1.2.2.4苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性测定。
①提取缓冲液的配制：取4.00 g PVP、58 mg EDTA，35 μL β-巯基乙醇，加100 mmol/L、pH 8.8硼酸缓冲液溶解、定容至100 mL，低温（4 ℃）保存备用。②酶液的制备：取5.00 g哈密瓜样品、5.00 mL提取缓冲液，混匀，并在冰浴条件下研磨成浆。随后在12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，收集上清液，冷藏备用。③酶活性测定：反应管中加入3.00 mL硼酸缓冲液（50 mmol/L、pH 8.8）和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸，37 ℃作用10 min后，加入0.5 mL酶提取液，混匀后测定波长290 nm处吸光值（OD0）。然后将反应管在37 ℃下保温60 min，随即混匀并测定波长290 nm处的吸光值（OD1），重复3遍。酶活计算公式如下：
PAL活性（U）=（OD1-OD0）×V0.01×Vs×t×W
式中，OD1为保温前反应液的初始值；OD0为保温后反应液的终止值；V为样品提取液总体积（mL）；Vs为所取样品提取液体积（mL）；t为酶促反应时间（h）；W为样品重量（g）。
1.2.2.5超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定。
①提取缓冲液的配制：称取77 mg DTT，5.00 g PVP，加入100 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液，定容至100 mL，混匀，低温贮藏备用。②酶液的制备：取5.00 g哈密瓜样品、5.00 mL提取缓冲液，混匀后在冰浴条件下研磨成浆。在12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，收集上清液，冷藏备用。
③酶活性测定：向指形玻璃管中加入表1所列溶液，混合均匀，再加入核黄素溶液。将4支反应管置于4 000 lx日光灯下，反应15 min，随后置于暗处以终止反应，设置1支对照管置于暗处作对比。以对照管为参比，测定各管在波长560 nm处的吸光值。酶活计算公式如下：
SOD活性（U）=（ODC-ODS）×V0.5×ODC×Vs×t×W
式中，ODS为照光对照管的吸光度值；ODC为样品管的吸光度值；V为样品提取液總体积（mL）；Vs 为所取样品提取液体积（mL）；t为光照反应时间（min）；W 为样品重量（g）。
1.3统计分析试验数据分析采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）；使用Excel软件分析，采用0.05水平；所有试验均重复3次。
2结果与分析
2.1不同紫外线处理对POD活性变化的影响
POD为有机体内重要的自由基清除剂，随着POD活性的增加，有机体的自我防御能力加强[9]。POD活性随着贮藏时间的延长而增加，随后逐渐下降并趋于平衡，如图1所示。低温贮藏条件下，紫外线各处理组在贮藏第28天时POD活性受到抑制，对照组在第21天受到抑制。紫外线处理时间越长，POD活性越大。
2.2不同紫外线处理对PPO活性变化的影响
哈密瓜在后熟和加工过程中，PPO能催化多种酚类物质氧化形成醌类化合物，并进一步聚合形成褐色或黑色聚合物，也就是常出现的褐变现象[10]。如图2所示，哈密瓜PPO活性随贮藏时间延长而逐渐增大，紫外线处理组第14天时PPO活性达到最大，第21天后受到抑制，酶活下降，贮藏后期下降幅度缓慢。紫外线处理50 min组的PPO活性波动范围不大，且低于对照组和其他处理组。进一步增大紫外线处理时间（70 min），PPO活性升高。
2.3不同紫外线处理对LOX活性变化的影响
LOX是引起哈密瓜后熟衰老的重要酶之一，它与后熟衰老过程的启动、细胞脂质过氧化等密切相关[11-12]。如图3所示，哈密瓜的LOX活性呈现上升趋势，并在第14天达到峰值，随后LOX活性开始下降并趋于平衡。相对于对照组和其他处理组，紫外线处理50 min时，LOX活性最低。结果表明，经紫外线处理后，LOX的蛋白结构可能被破坏，而起到对LOX活性的钝化作用。
2.4不同紫外线处理对PAL活性变化的影响
植物在感病或受到诱导剂诱导后，体内的PAL活性是升高的[11]。哈密瓜在冷藏过程中，PAL活性逐渐升高，14 d后趋于平衡，如图4所示。各处理组的PAL活性均在第7天时达到最大，随着贮藏时间延长，PAL活性受到抑制，后又缓慢上升。其中经紫外线处理的PAL活性均高于对照组，结果表明，紫外线处理可明显提高PAL活性，这将有利于哈密瓜的贮运与加工。
2.5不同紫外线处理对SOD活性变化的影响
SOD可通过与过氧化氢酶（CAT）和POD等酶类的协同作用，清除机体内的自由基，以防止活性氧对膜系统的伤害，从而使机体免受自由基的毒害[12]。随着冷藏时间的延长，哈密瓜SOD活性逐渐增大，后趋于平衡。从图5可看出，经紫外线处理后，哈密瓜的SOD活性高于对照组，其中处理50 min时的SOD活性最高。试验结果表明，经过紫外线处理的哈密瓜SOD活性上升，可减少自由基对哈密瓜的毒害作用，有利于哈密瓜的长期保存。
3结论
该研究得出，经紫外线杀菌处理后，哈密瓜的POD和SOD活性被激活，PPO和LOX活性被钝化；同时，果实内的PAL活性明显提高。经对比分析，以紫外线处理50 min对延缓新疆哈密瓜果实后熟衰老的效果最佳。
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