大鲵泛素结合酶cgsUBE2L3基因克隆及其在免疫应答中的表达分析
摘要[目的] 研究泛素结合酶UBE2L3基因在大鲵免疫应答过程中的作用。 [方法] 克隆大鲵泛素结合酶基因（cgsUBE2L3），进行相关生物信息学分析，并通过qRT-PCR对其组织分布及免疫刺激下的表达谱进行分析。 [结果] 成功克隆了cgsUBE2L3基因，该基因全长包含一个462 bp的开放阅读框，编码154个氨基酸，预计蛋白分子量为21.2 ku；cgsUBE2L3氨基酸序列保守性很高，与非洲爪蟾的同源性高达97.4%；此外，qRT-PCR结果显示，cgsUBE2L3基因在大鲵组织中广泛分布，且被LPS感染的大鲵多个免疫组织中cgsUBE2L3的mRNA水平均发生了明显变化。 [结论] cgsUBE2L3基因具有高度保守的结构特征，其组织分布具有特异性且参与大鲵抵抗LPS刺激的免疫应答。
关键词大鲵；UBE2L3；序列分析；免疫应答
中图分类号S966.6文献标识码A文章编号0517-6611（2017）22-0093-05
Abstract[Objective] To study the role of ubiquitinconjugating enzyme cgsUBE2L3 gene during the immune response in Chinese giant salamander （Andrias davidianus）. [Method] To clone ubiquitinconjugating enzyme gene from Chinese giant salamander （cgsUBE2L3） and analyzed its amino acids by bioinformatics software， the tissue distribution and expression profile with the stimulation of lipopolysaccharide （LPS） were detected by qRTPCR. [Result] Successfully， we cloned cgsUBE2L3 gene. The fulllength cDNA of cgsUBE2L3 contained an open reading frame of 462 bp， encoding a protein of 154 amino acids with a putative weight of 21.2 ku. The cgsUBE2L3 had a highly conserved amino acid sequence and shared the highest identity of 97.4% with African clawed frog. Quantitative real time PCR results showed that the cgsUBE2L3 gene was widely distributed in the Chinese giant salamander tissues and the mRNA levels of cgsUBE2L3 were significantly changed in the immuneassociated tissues of LPSinfected Chinese giant salamander. [Conclusion] The cgsUBE2L3 gene has highly conserved structural feature and tissuespecific of mRNA expression. Moreover， it participates in the immune response of Chinese giant salamander to resist LPS stimulation.
Key wordsChinese giant salamander；UBE2L3；Sequence analysis；Immune response
泛素（Ubiquitin，Ub）是一种由76個氨基酸组成的小分子蛋白质，因在真核生物中广泛存在而得名，它的主要作用是对需要分解的蛋白质进行标记，使其能够被26S蛋白酶体降解[1]。通过泛素化修饰靶蛋白，降解异常或者半衰期短的蛋白，是真核生物体蛋白降解的主要途径，对维持真核生物体内环境稳定有重要作用。此外，泛素化还参与调控多种细胞的生理过程，包括细胞周期、信号转导，转录调节及炎症反应等[2-5]。泛素化过程至少涉及3种酶的参与：泛素激活酶（UbiquitinActivating Enzyme，E1）、泛素结合酶（UbiquitinConjugating Enzyme，E2）和泛素连接酶（UbiquitinProtein Ligase，E3）。E1利用ATP提供的能量将Ub活化，通过转硫醇作用将活化的Ub传送到E2的半胱氨酸残基活化位点，最后E3与E2-Ub复合体结合对靶蛋白进行泛素修饰，泛素化的蛋白随后被26S蛋白酶体降解。其中，E2是泛素化中间环节的酶，主要参与转硫醇作用和氨解作用，在整个泛素过程是十分重要的。
E2家族成员大多包含一个催化域（Ubiquitin-Conjugating enzyme，Catalytic domain，UBC），约由150个氨基酸组成，同时还有一个简单的活性部位，可直接接触靶蛋白发挥修饰作用，此过程不需要E1或E3的参与[6-7]。UBC由4个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成，结构十分紧凑且高度保守。尽管大多数E2只含有一个结构功能域UBC，但是许多在N或C端都有用来实现特殊功能的相应的扩展结构，用于调节其他酶的活性[8-9]。泛素结合酶E2L3（UBE2L3，也称E2-F1，L-UBC和UBCH7等）是E2泛素结合酶家族成员，在体外参与p53、c-Fos和NF-κB前体蛋白p105的泛素化[10]。目前，关于UBE2L3基因的研究主要集中在人和植物中，在其他物种中的研究少见报道。
大鲵（Andrias davidianus），俗称“娃娃鱼”，属于两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是我国特有的大型珍稀两栖类动物，与蚓螈、蛙并称为现存的三大主要两栖类动物。大鲵起源于泥盆纪时期，由水生鱼类演变而成[11]，其心脏构造特殊，已出现了一些爬行類的特征，因此在研究物种起源和基因家族进化上具有极高的科研价值[12-13]。此外，大鲵肉质鲜美，富含多种人体必需的氨基酸及微量元素，被誉为水中“活人参”，具有极高的营养价值和药用价值。然而，随着栖息地的减少、传染病[14]和环境污染等一系列因素的影响，大鲵一度濒临灭绝，因此被列为国家二级保护动物。为保护大鲵得以生存和繁衍，人们研究的首要任务是提高大鲵的种群数量，为此应着眼于野生大鲵保护工作的加强和人工养殖技术的推广，但在这2个过程中势必面临着疾病防治的问题。对大鲵免疫系统进行研究不仅有助于了解进化免疫学的信息，还能为大鲵人工养殖过程中的疾病防治提供理论指导。
1材料与方法
1.1试验试剂
RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen，德国），SMART cDNA library construction kit（Clontech，美国），DH10B Competent cell（Tiangen，北京），Vitagene 96-easy plasmid Miniprep kit（Vitagene，意大利），THERMO script OneStep qRT-PCR Kit（Thermo Scientific，美国），LPS（Sigma，美国），其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2大鲵与免疫刺激
子二代大鲵，体重（250±25）g，购自浙江省温州市乐清市高塘大鲵养殖基地，饲养在干净的水槽中。每3尾大鲵为1组，用200 μL 0.5 mg/mL的LPS通过腹腔注射刺激大鲵，LPS溶解在PBS溶液中。分别刺激0、12、24、48、72 h后，从预先麻醉的大鲵中分离脾脏、肝脏、肾脏、心脏、小肠、肌肉、脂肪、骨和脑组织，立即冻存在液氮中，用于组织RNA提取和实时定量PCR（qRT-PCR）检测。以200 μL PBS处理大鲵组作为阴性对照。
1.3RNA抽提，cDNA文库构建及EST测序
根据说明书，使用RNeasy Plus Mini Kit提取大鲵脾脏总RNA，通过分析28S和18S及测量的OD260/OD280比值鉴定提取RNA的质量。随后使用SMART cDNA library construction kit构建大鲵脾脏全长cDNA文库。将所有长度大于500 bp的cDNA片段连接至pDNR-LIB载体，转化DH10B感受态细胞。随机挑取不同的cDNA阳性克隆菌，直接接种到含有1 mL YT培养基的96孔板中，37 ℃孵育过夜。利用Vitagene 96-easy plasmid Miniprep kit抽提菌液中的DNA，送往上海生工生物公司进行测序。使用T7引物，从5′端测序，筛选cgsUBE2L3基因cDNA序列。
1.4生物信息学分析
通过BioxM 2.6软件分析cgsUBE2L3基因cDNA序列；其功能结构域通过SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行在线分析；cgsUBE2L3
氨基酸同源性比对及保守结构的分析通过BioEdit软件完成；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在线预测cgsUBE2L3蛋白空间结构模型；使用MEGA6.0软件构建N-J系统发育树。
1.5qRT-PCR 分析
根据RNeasy Plus Mini Kit提取大鲵脾脏、肝脏和肌肉等组织总RNA，用RNase-free DNase I 进行处理。取同等质量的各组织总RNA通过THERMO script OneStep qRT-PCR Kit进行qRT-PCR检测。反应体系25 μL，以β-actin为标准内参，每个反应重复3次。程序如下：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，38个循环。在每个PCR反应结束后分析扩增产物的熔解曲线，确保只有一个PCR产物被扩增并检测。通过循环阈值比较法（Δ ct）分析cgsUBE2L3基因的表达水平。试验过程涉及到的引物信息见表1。
1.6统计学分析
试验数据用SPSS 6.0软件通过单因素变量比较法进行分析。
2结果与分析
2.1cgsUBE2L3基因cDNA序列及功能域分析
cgsUBE2L3基因全长包含一个462 bp的开放阅读框，编码154个氨基酸（图1），预计蛋白分子量为21.2 ku，等电点为9.36。SMART结构预测结果显示（图2），cgsUBE2L3蛋白含有一个E2家族共有的、完整的泛素结合酶结构域（UBC），该结构域由145个氨基酸组成，是cgsUBE2L3的主要功能结构。
2.2cgsUBE2L3氨基酸序列分析
通过BioEdit软件将cgsUBE2L3氨基酸序列与其他已知物种的UBE2L3进行两两比对，结果如表2所示。cgsUBE2L3与非洲爪蟾的UBE2L3氨基酸序列同源性高达97.4%，与鸡的同源性次之，为96.7%，与绿海龟的同源性最低，为88.9%，说明UBE2L3氨基酸在物种进化过程中是非常保守的。
UBE2L3氨基酸多序列比对结果（图3）同样能够说明，UBE2L3氨基酸在进化上是高度保守的，并且含有一个保守的半胱氨酸活性位点（C86，用竖框表示），负责结合活化的泛素分子。
基于序列保守性的前提，模拟了cgsUBE2L3的三维结构模型（图4）。结果显示，cgsUBE2L3蛋白主要由4个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成，与数据库中已有的UBE2L3结构是一致的。
2.3系统进化树分析
为了研究cgsUBE2L3氨基酸的进化关系，利用MEGA 6.0软件构建了N-J系统进化树（Bootstrap：1 000），结果显示（图5），cgsUBE2L3的氨基酸序列在魚类（大西洋鲑鱼）和蛙类（非洲爪蟾）之间，与两栖类归为一簇，符合大鲵物种在进化上的规律。
2.4cgsUBE2L3组织分布及免疫刺激应答分析
通过qRT-PCR检测cgsUBE2L3基因在大鲵各个组织中的表达分布，结果发现，cgsUBE2L3在大鲵组织中广泛存在，且相对表达水平较高（图6）。用LPS刺激一定时间后，检测被感染的大鲵组织中cgsUBE2L3的mRNA表达变化，结果显示，在LPS感染48 h后，大鲵肾脏、心脏、脾脏、小肠及骨中cgsUBE2L3的mRNA表达均发生明显上调，而肌肉和脂肪组织中的表达几乎无变化（图7）。
3结论与讨论
通过分子生物学手段，从构建的大鲵脾脏cDNA文库中鉴定了大鲵泛素结合酶基因（cgsUBE2L3），该基因cDNA序列全长包含一个462 bp的开放阅读框，可编码154个氨基
酸。与已知物种的UBE2L3氨基酸序列进行对比，发现cgsUBE2L3氨基酸与非洲爪蟾的UBE2L3同源性最高，达974%，与鸡的同源性次之（96.7%），之后是爬行类的扬子鳄与松狮蜥，两者均为96.1%。虽然大鲵是远古水生鱼类演化而来的两栖纲物种，但是由于大鲵心脏构造特殊，已经出现了一些爬行类的特征，因此某些基因在进化上与爬行类的较为接近。氨基酸多序列对比及功能域分析结果显示，UBE2L3在物种进化过程中是高度保守的，cgsUBE2L3与其他物种的UBE2L3一样，都具有E2家族共有的催化功能域（UBC）及保守的半胱氨酸活性位点（C86），通过与泛素分子及E1、E3相互作用，参与泛素化降解过程，维持细胞正常的生命活动。cgsUBE2L3的空间结构较为简单，主要包括4个α螺旋和4个β折叠，C端及N端均没有拓展氨基酸，或许在一定程度上使泛素结合酶的活性更加专业。根据已有UBE2L3氨基酸序列构建的N-J系统进化树结果表明，大鲵与非洲爪蟾的亲缘关系最近，其次为扬子鳄、松狮蜥和美国牛蛙，而与鱼类的亲缘关系相对较远，大鲵UBE2L3氨基酸此外，在mRNA水平研究了cgsUBE2L3的组织分布及其在细菌感染的大鲵组织中表达量的变化，结果发现，cgsUBE2L3在大鲵组织中广泛分布，且表达量相对较高。当受到LPS刺激时，24 h内，大鲵各组织中cgsUBE2L3的mRNA表达量无明显变化，48 h后，脾脏、头肾、小肠和骨等免疫器官中cgsUBE2L3的表达量明显升高，而脂肪和肌肉等非免疫器官中的cgsUBE2L3的表达几乎未变，预示cgsUBE2L3与免疫相关，参与了大鲵抵抗LPS产生的免疫应答。
泛素蛋白酶体系统是细胞内一系列生命进程的调节方式，与疾病密切相连，该文以进化上具有代表性的两栖类大鲵为研究对象，鉴定了一种大鲵泛素结合酶基因——cgsUBE2L3，该基因在进化上具有高度的保守性，且参与大鲵抵抗LPS刺激产生的免疫应答，为进一步研究大鲵免疫系统与疾病防治提供了理论支持。
参考文献
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