酶联免疫法（ELISA）测定月饼中黄曲霉毒素B1
材料与方法
1.1 材料
月饼，随机购于广东省某超市，品种包括五仁、蛋黄莲蓉、水果、火腿4种口味，各8批次共32批次；甲醇、三氯甲烷、无水硫酸钠，均为分析纯。
1.2 仪器
Thermo multiskan MK3型酶标仪，美国热电公司产品；HY-5型水浴恒温回旋振荡器，国华电器有限公司产品；恒温干燥箱，德国BINDER公司产品；黃曲霉毒素B1检测试剂盒，德国R-Biopharm拜发有限公司产品。
1.3 方法与步骤
1.3.1 样品前处理方法
参照国标（GB/T 5009.22—2003），准确称取20.0 g粉碎样品于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL的甲醇-水（55∶45）提取液和30 mL正己烷，振荡30 min，过滤于125 mL分液漏斗中，静置分层，取下层清液于烧杯中，准确量取20 mL三氯甲烷，加塞振荡2 min，静置分层，经盛有约10 g预先用三氯甲烷润湿的无水NaSO4定量快速滤纸过滤于蒸发皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，将三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量的三氯甲烷洗涤无水Na2SO4过滤器，洗液滤于蒸发皿中，将蒸发皿放入通风橱于65 ℃水浴挥干，用10 mL甲醇- PBS（2∶8）将凝结物分3次溶解，制作样品提取液。
1.3.2 检测步骤
将测试盒放置于室温中30 min，平衡至室温 25 ℃；准确加入1.5 mL酶标抗原稀释液，充分溶解，稀释为试验用酶标抗原溶液，于2～8 ℃下保存；取适量浓缩洗涤液，用蒸馏水稀释20倍，作为试验用洗涤液。酶联免疫试验详细步骤如下：①根据待测样品量，截取相应酶标板孔数，每孔加入250 L洗涤液洗涤，放置1 min后甩掉洗涤液，在吸水纸上排干，重复洗板1次。②依次加入配置好的标准溶液和月饼样品提取液50 L，除仪器调零孔加入50 L酶标抗原稀释液外，其余各孔均加入50 L酶标抗原溶液。③将反应板放入37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。④取出反应板，用力甩掉反应液，拍干后，每孔加入250 L洗涤液洗涤，重复洗板4次。⑤每孔加入显色底物液A和B，摇匀，将反应板放入37 ℃恒温培养箱中显色15 min。⑥显色结束后，每孔加入50 L终止液，摇匀后用酶标仪于波长450 nm处测定各孔的吸光度。
1.3.3 方法评价
从方法的线性、回收率、灵敏度、重现性4个方面，对月饼中黄曲霉毒素B1的酶联免疫法进行方法评价。
1.3.4 结果计算
样品中黄曲霉毒素B1含量按式（1）计算：
式中：W——试样中黄曲霉毒素B1含量，g/kg；
C——样品液中黄曲霉毒素B1含量，g/kg；
V——样品定容体积，mL；
m——样品质量，g；
D——稀释倍数。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法筛选
对于月饼的前处理方法，试验测试了2种提取溶剂，一种是以甲醇为提取溶剂，分别设置甲醇与水的体积比为1∶1和7∶3；另一种是三氯甲烷。通过比较，用三氯甲烷作为提取溶剂，回收率达标，本底值偏低，对试验结果干扰小，最后选定三氯甲烷作为提取溶剂。
2.2 线性
将系列黄曲霉毒素B1标准溶液（0，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 g/L）测得的吸光度，绘制标准曲线，横坐标为标准曲线质量浓度的常用对数值（lgC），纵坐标为各标准液吸光度与0 ng/mL标准溶液孔吸光度的比值，得线性方程Y=-40.291C+88.365，黄曲霉毒素B1在0～50.00 μg/L范围内呈线性相关。
黄曲霉毒素B1标准曲线见图1。
2.3 灵敏度测定
按照试验步骤，通过依次添加黄曲霉毒素B1到样品中，降低黄曲霉毒素B1于波长450 nm处的光密度来确定最低检测浓度，即检测的灵敏度。
黄曲霉毒素B1灵敏度试验见表1。
由表1可知，黄曲霉毒素B1含量为1.00 g/kg时，酶标仪于波长450 nm处的吸光度为1.812。与黄曲霉毒素B1为0时的吸光度1.714之差大于0.1，此值可确定为此方法的灵敏度，由于对黄曲霉毒素B1的最低检出量为1.00 g/kg，因此将月饼黄曲霉毒素B1的检测灵敏度确定为1.00 g/kg。
2.4 回收率
选2#月饼样品作为添加回收试验样品，分别添加0，1.5，3.0，5.0 g/kg，按照试验步骤测定添加样品中黄曲霉毒素B1含量，每个样品做3个重复，样品的加标回收率在95%左右。
黄曲霉毒素B1回收率试验见表2。
2.5 重现性
按照试验检测步骤重复测定月饼中黄曲霉毒素B1的含量6次，计算其标准差和相对标准偏差。
黄曲霉毒素B1重现性试验见表3。
由表3可知，多次样品测定的平均值为1.441，标准差为0.03%，相对标准偏差为1.96%，重现性能够满足分析方法的要求。
2.6 不同品种月饼中黄曲霉毒素B1的含量
选取目前市场上消费较多的五仁、蛋黄莲蓉、水果、火腿4类月饼样品，样品编号1～9测定黄曲霉毒素B1的含量。
月饼中黄曲霉毒素B1含量的测定见表4。
由表4可知，9个随机购买的月饼样品中均检出黄曲霉毒素B1[4]，其中3个样品黄曲霉毒素B1含量小于0.5 g/kg，4个样品黄曲霉毒素B1含量为0.5～ 1.0 g/kg，2个样品黄曲霉毒素B1含量大于1.0 g/kg且小于2.0 g/kg。总体来看，随机购买的月饼样品中黄曲霉毒素B1含量低。参考食品中真菌毒素限量标准（GB 2761—2011），抽取的9个月饼样品中黄曲霉毒素B1含量均未超标。
3 结论
在测定的9个月饼样品中，虽然黄曲霉毒素B1含量没有超出标准，但是检出率达100%，由此观之，月饼作为一种受欢迎的食品，存在一定的食品安全风险。月饼因含有大量油脂、糖分、蛋白质，黄曲霉毒素B1污染可能性较大。
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