生化实验报告-蛋白质测定

　 生物化学实验报告

　姓

　名：

　* * ***

　 学

　号：

　专业年级：

　组

　别：

　 * * **** 实验教学中心

　 实验名称

　Folin- - 酚试剂法测定蛋白质含量

　实验时间

　*** 实验地点

　*** 指导老师

　组员

　*** 评分

　批改日期

　第一部分

　一、 实验目的

　掌握程度 实验主要目的

　了解蛋白质含量测定的常用方法

　 掌握 Lowry’s 法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量的原理和基本操作技术

　 掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法

　二、

　实验原理

　掌握程度 原理 具体内容

　 双缩脲反应

　 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与 Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

　 Folin-酚显 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼

　 色反应

　 酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

　 标准曲线

　 在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。

　即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

　 三、

　材料与方法

　1、实验材料

　 本次实验仪器

　1. V-1100 分光光度计 2. 恒温水浴箱 3. 试管 6 支、试管架 4. 加样枪、加样枪架 5. 坐标纸 本次实验试剂

　1. 牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）

　2. 碱性硫酸铜溶液（当日有效）

　3. Folin-酚试剂 4.健康人血清（300 倍稀释）

　 2、实验方法

　 3、操作步骤：

　试剂（ ml) 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液 样品液（稀释 0 300 倍）

　蒸馏水 碱性硫酸铜

　蛋白质浓度（μ g/ml ）

　- - 1.0 2.0 0 0.20 - 0.80 2.0 40 0.40 - 0.60 2.0 80 0.60 - 0.40 2.0 120 0.80 - 0.20 2.0 160 - 0.50 0.50 2.0 未知 （1）各管混匀，室温放置 10min。

　（2）向各管内加入 Folin-酚试剂 0.20mL, 2s 内迅速混匀！

　40℃放置 10min。

　（3）冷却至室温后，以 500nm 波长比色，用 1 号管作空白，读取各管吸光度。

　4、注意事项 Folin- - 酚 试 剂的稳定性问 题 Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。故当 Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），蛋白样品 碱性铜试剂 混匀，放 10min 加酚试剂 2s 混匀 水浴 10min 比色 放至室温

　 使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

　时间问题 因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第 1 支试管加入 2.0mL 碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第 2 支试管加入 2.0mL 碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第 3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.20mL Folin-酚试剂，1 分钟后第 2 支试管加入 0.20mL Folin-酚试剂，2 分钟后加第 3 支试管，以此类推。水浴 10min，冷却后，每一分钟测一管。

　 第二部分

　一、实验结果与处理

　1.数据记录

　测定次数 各管吸光度测量值 A500 2 号试管 3 号试管 4 号试管 5 号试管 6 号试管 1 2 3 平均值 A500 0.030 0.031 0.032 0.031 0.063 0.064 0.065 0.064 0.088 0.087 0.087 0.087 0.147 0.144 0.144 0.145 0.136 0.133 0.133 0.134

　 2.绘制标准曲线 标准曲线y = 0.0008xR 2

　= 0.954100.020.040.060.080.10.120.140.160 50 100 150 200c(ug/ml)A（吸光度）A(吸光度）0.000线性 (A(吸光度）0.000)

　二、实验结果的计算和讨论

　1、结果计算

　如上图 y=0.0008x 当 y=0.134 时 x=167.5ug/ml 血清中含有的蛋白质数有为：167.5×2×300×0.001=100.5g/l

　2、讨论与分析 参考：正常人的血清蛋白浓度范围为 60-80g/l

　实验结果：实验测得正常人血清蛋白含量是 100.5g/l

　实验的失误可能发生在: 导致失败的可能原因 A、时间没有严格控制好，在实验时没有严格按照实验时间要求操作，造成 Lowry 反应的显色随时间过长，颜色过深，使结果偏大 B、用于加蒸馏水的加样枪出现问题，加入的蒸馏水量偏小

　 其他能影响实验误差的原因 C、分光光度计的装液管有洗不净的污染 D、Folin-酚试剂，牛血清白蛋白标准液为多个小组共同使用，有可能在之前组被污染

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