外源茉莉酸甲酯对牛樟芝产总三萜及多糖含量的影响

计划项目青年项目（编号：2016FD096）。

作者简介：张知晓（1988—），女，云南个旧人，硕士，助理研究员，研究方向为森林微生物资源的开发与利用。E-mail：36062613@qq.com。

通信作者：户连荣，硕士，助理研究员，研究方向为森林生态保护与研究。E-mail：444387051@qq.com。

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、樟生薄孔菌等，是分属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌属（Antrodia）的珍稀药用真菌[1]，被誉为“森林中的红宝石”[2]。牛樟芝中的三萜类物质是其最主要的1种药用化学成分，可以起到保肝护肝、抑制癌细胞生长、降血压、抗炎症的作用，且牛樟芝中三萜类化合物的含量和种类都是灵芝的数倍，樟芝三萜也因此成为开发樟芝的研究重点之一[3]。此外，樟芝中含有的多糖对人体起到提高免疫力、抑制病毒的作用，对保护肝脏也有一定的效果[4]。

茉莉酸甲酯（MeJA）是一种脂肪酸衍生物，在植物中起着信号传递的作用，同时能够明显促进植物产生次级代谢产物[5]。已有研究表明，将MeJA作为诱导剂添加到灵芝（Ganoderma lucidum）和桦褐孔菌（Inonotus obliquus）的发酵培养基中，发酵后的三萜产量均较对照有明显提高[6-7]。而在这方面，关于同属多孔菌目牛樟芝的研究还未见报道。此外，钙（Ca）是生物生长必需的营养元素，参与构成生物组织，调节生物生长发育，参与调控植物抗逆等生理反应[8]。已有部分研究发现，Ca2+参与MeJA介导的信号转导过程，如马泓思等发现，外源Ca2+离子能进一步增强MeJA 诱导的白桦（Betula platyphylla）细胞悬浮液合成三萜类物质的效果[9]。而关于Ca2+促进MeJA诱导真菌合成三萜类物质方面的研究尚未见报道。基于牛樟芝中的三萜、多糖具有极高的药用价值，本研究以牛樟芝为试验材料，研究MeJA对牛樟芝2种药用成分的影响及Ca2+处理对MeJA作用的影响，以期初步探明1种增加牛樟芝三萜及多糖产量的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所用菌种为从中国台湾引进的牛樟芝优良菌株。

1.1.1 培养基和菌株培养条件 基础培养基配方：25 g葡萄糖，5 g蛋白胨，3 g麦芽糖，3 g酵母提取物，1 g KH2PO4，1 g MgSO4，1 g维生素B1，1 L水，pH值5.5。

孢子悬浮液的制备方法：取已培养20d的牛樟芝培养皿，用20 mL无菌水洗下培养皿表面的孢子备用。

基础培养方法：在500 mL三角瓶中装100 mL基础培养基，接入1 mL牛樟芝孢子悬浮液，摇床上于100 r/min、26 ℃恒温培养12 d后，收集菌丝。

1.1.2 主要试剂 茉莉酸甲酯，购于Sigma公司;齐墩果酸及其他试剂，购于昆明腾科科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验时间和地点 本试验于2018年3—7月在云南省林业科学院实验室内进行。

1.2.2 样品处理 （1）将MeJA用无水乙醇配制成终浓度为25、50、75、100、200 μmol/L的溶液。采用0.2 μm的无菌针头式过滤器过滤进行灭菌处理后，在基礎摇瓶发酵方法的基础上，于4 d后添加到培养基中，添加量为2 μL/mL，摇床培养，每个处理设3个重复。培养结束后取样分析其生物量、总三萜量、胞内多糖和胞外多糖量。

（2）将MeJA用无水乙醇配制成终浓度为50 μmol/L的溶液。于不同培养时间（培养0、2、4、6、8d）添加到培养基中，摇床培养，每个处理设3个重复。培养结束后取样分析。

（3）以无水乙醇、吐温-20、吐温-80作为助溶剂，将MeJA配制成终浓度为50 μmol/L的溶液，于4 d后添加到培养基中，摇床培养，每个处理设3个重复。培养结束后取样分析，筛选出MeJA的最佳添加方案。

在MeJA最佳添加方案的基础上，向培养基中同时添加CaCl2，使CaCl2的终浓度为75 nmol/L。另外设置2组对照组，分别仅向培养基中添加MeJA、CaCl2。设3组独立试验。培养结束后取样分析其生物量、总三萜量、胞内多糖和胞外多糖量。

1.2.3 生物量的测定 生物量的测定方法参照文献[10]。通过抽滤分离发酵液与菌丝体，菌丝体用蒸馏水反复冲洗至洗液变为无色，置于干燥箱中，于70 ℃烘干至恒质量，对干燥菌丝体用精度为0.001 g的电子天平称量，即得菌丝体生物量。

1.2.4 菌丝体内总三萜含量的测定 采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色体系对总三萜含量进行测定。具体步骤参考杨彬君等的方法[11]。

1.2.5 胞外多糖含量的测定 胞外多糖含量的测定方法参照文献[12]。将发酵液（用滤纸）过滤，取100 mL滤液在 60 ℃ 下旋转蒸发，使滤液浓缩至原体积的1/3，加3倍体积的无水乙醇静置沉淀24 h，4 000 r/min离心分离15 min，沉淀经无水乙醇轻轻冲洗后，用烘箱于50 ℃烘干至恒质量，得到胞外粗多糖。

1.2.6 胞内多糖含量的测定 胞内多糖含量的测定方法参照文献[13]。将菌丝体用烘箱烘干至恒质量，研磨过筛，置于圆底烧瓶中，加30倍体积的水，于80 ℃水浴1 h，水浴提取后，再用超声波提取30 min，重复2次提取多糖，合并提取液，离心、过滤，滤液用硫酸-苯酚法测定多糖含量。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS 11.5软件对数据进行统计和数理分析。

2 结果与分析

2.1 MeJA不同添加浓度对牛樟芝发酵特性的影响

MeJA不同添加浓度对牛樟芝生物量及三萜含量的影响如图1-a所示，可见当MeJA添加浓度为25 μmol/L时，1L发酵液中的牛樟芝生物量达9.46 g;当MeJA添加浓度为50 μmol/L 时，牛樟芝的生物量达9.25 g/L，与MeJA添加浓度为25 μmol/L处理间的生物量无显著差异;当MeJA添加浓度为0 μmol/L时，牛樟芝的生物量较MeJA添加浓度为 25 μmol/L 时降低了2.55 g/L，但显著高于MeJA添加浓度为100、200 μmol/L时的生物量。三萜含量在MeJA添加浓度为50 μmol/L时最高（14.21 mg/g），其次为MeJA添加浓度为25、100 μmol/L的处理，当MeJA添加浓度为0、200 μmol/L时，三萜含量最低。

MeJA不同添加浓度对牛樟芝胞外多糖及胞内多糖含量的影响如图1-b所示，可见当MeJA添加浓度为50 μmol/L时，牛樟芝胞外多糖、胞内多糖含量均最高，分别为 10.27 g/L、11.5mg/g;当MeJA添加浓度为0、200 μmol/L时，胞外多糖含量均较低，二者间无显著差异，而当胞内多糖含量最低时，对应的MeJA添加浓度为200 μmol/L。

2.2 MeJA不同添加时间对牛樟芝发酵特性的影响

MeJA不同添加时间对牛樟芝生物量及三萜含量的影响如图2-a所示，可以看出，于培养4 d时添加MeJA发酵的牛樟芝生物量显著高于其他时间的生物量，为12.04 g/L，而于培养8 d时添加MeJA产生的生物量最低，仅为7.11 g/L。于培养0、2、4 d时添加MeJA的三萜含量分别为15.48、15.12、16.42 mg/g，三者间无显著差异，但显著高于其他试验组。

MeJA不同添加时间对牛樟芝胞外多糖及胞内多糖含量的影响如图2-b所示，可以看出，于培养4 d时添加MeJA发酵的胞外多糖含量最高，达15.18 g/L，于培养6、8 d时添加MeJA产生的胞外多糖含量较低，分别较培养4 d时降低了53%、60%。同样，于培养4 d时添加MeJA产生的胞内多糖含量最高（12.2 mg/g），其次是培养2 d时添加MeJA的胞内多糖含量，二者间无显著差异， 于培养8 d时添加MeJA产生的胞内多糖含量最低，仅为6.4 mg/g。

2.3 MeJA不同溶剂对牛樟芝发酵特性的影响

由表1可以看出，以吐温-80为溶剂的MeJA溶液对牛樟芝发酵后生物量的促进作用最佳，生物量达到8.25 g/L，单独添加吐温-80溶液的效果次之;以无水乙醇为溶剂的MeJA溶液处理的生物量为6.16 g/L，单独添加无水乙醇溶液的生物量为3.48 g/L;以吐温-20为溶剂的MeJA溶液和单独添加吐温-20的溶液发酵的牛樟芝生物量均为0 g/L。几组处理的三萜含量排序如下：添加MeJA（无水乙醇）溶液≥添加MeJA（吐温-80）溶液>吐温-80≥无水乙醇。

比较胞内多糖、胞外多糖含量可知，两者均在以吐温-20为溶剂的试验组最低，次低的是以无水乙醇為溶剂的试验组，而在以MeJA（吐温-80）溶液为溶剂的试验组最高，较无水乙醇试验组分别提高了71%、34%。

2.4 Ca2+介导MeJA的影响（添加Ca2+对MeJA诱导作用的影响）

如图3所示，发酵后牛樟芝生物量、胞外多糖含量和胞内多糖含量均呈现出相同的趋势，表现为MeJA+CaCl2>MeJA>CaCl2>CK，而发酵后的三萜含量为MeJA+CaCl2>MeJA>CK>CaCl2。其中，效果最好的MeJA+CaCl2组牛樟芝的生物量、三萜含量、胞外多糖含量和胞内多糖含量分别为 10.91 g/L、13.48 mg/g、6.36 g/L、8.80 mg/g，分别较CK提高了79.10%、27.90%、77.20%、103.02%。

3 结论与讨论

茉莉酸甲酯对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用[14]，近些年来也陆续出现将其用于微生物发酵上的研究。辛燕花等将MeJA添加于灵芝发酵培养基中，发现它能够提高灵芝多糖、灵芝酸的产量[15]。杨文建等发明了1种用MeJA溶液喷洒双孢蘑菇的方法，经证实该方法能够促进双孢蘑菇产麦角甾醇[16]。此外，MeJA还能够促进微生物细胞中萜类物质的合成，Ren等首次将MeJA作为诱导剂添加到灵芝发酵培养基中，发现其灵芝三萜的产量比未经处理的提高了45.3%[6]。向超也证实，用MeJA诱导桦褐孔菌发酵产三萜，其三萜总产量较对照提高了53.2%[7]。本研究结果表明，在液体发酵过程中添加MeJA，能显著提高牛樟芝发酵的生物量与三萜、胞外多糖、胞内多糖含量，最适宜的添加浓度为50 μmol/L，于培养4d时对各指标的促进效果最佳，以吐温-80作为溶剂最有利于MeJA发挥促进作用。而有研究发现，吐温-20对牛樟芝的生长具有强烈的抑制作用，这可能由于其具有较短的碳链，作为表面活性剂在细胞壁内表现出较高的扩散率，可能会造成细胞膜受损，或者影响与其他细胞内生物分子的相互作用，甚至会降低细胞的存活率[17]。

目前，MeJA诱导微生物产三萜的机制已经明确，这些萜类化合物都是由单个异戊二烯通过甲羟戊酸途径合成得到的，MeJA能够促使甲羟戊酸途径中hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs、osc、lss和ss等相关酶基因的超表达[18-21]。以茯苓为研究对象，探究MeJA诱导其产三萜的效果及机制发现，于发酵第4天添加MeJA溶液（150 μmol/L），可使得到的三萜含量较空白组增加0.55倍;实时荧光定量PCR分析可知，其sqs（甲基戊酸途径鲨烯合酶基因）和fps（法尼基焦磷酸合成酶基因）的表达水平均发生了显著上调[22]。任昂也以灵芝为材料，探究了在三萜的生物合成途径中，关键酶编码基因转录受MeJA的影响，结果表明，hmgr、fps、sqs、osc等基因均被诱导表达[23]。

钙有多种生物学功能，是非常重要的第二信使，通过改变细胞质中游离的Ca2+浓度，可以将细胞表面上接收的信号传递到细胞内，并由一系列效应器接收和分析，调节生物生长、发育等生理反应[24]，在微生物中，Ca2+经常作为活性酶的辅因子或激活因子发挥作用[25]。在本研究中，同时添加MeJA、CaCl2时，牛樟芝发酵后的生物量、三萜含量、胞外多糖和胞内多糖含量较单独添加MeJA及其他试验组明显提高。结果表明，Ca2+对MeJA诱导牛樟芝发酵产三萜等有用物质起到了积极的介导作用，这与王艳用Ca2+介导MeJA诱导白桦悬浮培养产三萜的试验结果相似[26]。

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