五味子酚上调SIRT1改善H2O2对SH—SY5Y细胞增殖的抑制作用研究
【摘要】 目的：探討SIRT1/LC3自噬通路在五味子酚（Schisanhenol，Sal）抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞增殖活力下降中的作用。方法：加入不同浓度Sal（50、10 μmol/L）处理SH-SY5Y细胞4 h后，再加入H2O2 100 μmol/L处理12 h，采用MTT法检测细胞增殖能力，Western blot检测SIRT1蛋白和自噬蛋白标志物（LC3蛋白、Beclin-1蛋白）的表达水平。结果：H2O2组细胞增殖活力较对照组显著下降（P<0.001）；Sal组不同浓度（50、10 μmol/L）干预后的细胞增殖活力均高于H2O2组（P=0.001、0.017），且随着Sal浓度增加，细胞增殖活力增强。H2O2组SIRT1蛋白含量较对照组明显降低（P<0.001），Sal组不同浓度（50、10 μmol/L）的SIRT1蛋白含量均明显高于H2O2组（P=0.001、0.014）。H2O2组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达均高于对照组，比较差异均有统计学意义（P<0.001）；Sal组（50 μmol/L）的Beclin-1的蛋白表达低于H2O2组，且不同浓度（50、10 μmol/L）LC3-Ⅱ蛋白表达均低于H2O2组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：Sal可通过上调SIRT1蛋白表达，拮抗H2O2引起的过度自噬，从而起到拮抗H2O2对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用。
【关键词】 五味子酚； SIRT1； 过氧化氢； LC3
Study on the Inhibitory Effect of Schisanhenol Up-regulated SIRT1 Improve H2O2 on the Proliferation of SH-SY5Y Cells/YANG Hongyan，MA Shuli，LI Qingyi，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（06）：032-035
【Abstract】 Objective：To investigate the role of SIRT1/LC3 autophagy pathway in the decrease of proliferation activity of SH-SY5Y cells induced by H2O2 in Schisanhenol（Sal）.Method：SH-SY5Y cells were treated with different concentrations of Sal（50 and 10 μmol/L） for 4 h and then added H2O2 100 μmol/L for 12 h.
The cell proliferation activity was detected by MTT，and the expressions of SIRT1 protein and autophagic protein markers（LC3 protein，Beclin-1 protein） were detected by Western blot.Result：The cell proliferation activity of H2O2 group was significantly lower than that of control group（P<0.001），the proliferative activity of Sal group at different concentrations（50，10 μmol/L） was higher than that of H2O2 group（P=0.001，0.017），and the cell proliferation activity increased with the increase of Sal concentration.The content of SIRT1 protein in H2O2 group was significantly lower than that of control group（P<0.001），and the content of SIRT1 protein in Sal group at different concentrations（50，10 μmol/L） was significantly higher than that of H2O2 group（P=0.001，0.014）.The expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in group H2O2 were higher than those of control group，the differences were statistically significant（P<0.001），the protein expression of Beclin-1 in Sal group（50 μmol/L） was lower than that of H2O2 group，and the expression of LC3-Ⅱ protein in different concentrations（50，10 μmol/L） was lower than that in H2O2 group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Sal can attenuate the excessive autophagy induced by H2O2 by up regulation of the expression of SIRT1 protein，thus antagonizing the inhibitory effect of H2O2 on the proliferation of SH-SY5Y cells.
【Key words】 Schisanhenol； SIRT1； Hydrogen peroxide； LC3
First-author’s address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.06.009
五味子酚（schisanhenol，Sal）是从传统中药五味子果仁中提取的木脂素类成分之一。药理实验表明，Sal具有显著的抗氧化活性，对神经细胞损伤具有明显的保护作用[1-3]。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的赖氨酸脱乙酰酶，可促进赖氨酸残基的乙酰基的裂解。SIRT1与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关，在氧化应激中起重要作用[4-6]。过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）是一种常见的氧化应激诱导剂，经过H2O2处理的细胞能在短时间内产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），进而诱发细胞凋亡[7]。本研究以体外培养的人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）为研究对象，建立H2O2神经细胞损伤模型，探讨SIRT1/LC3自噬通路在Sal神经细胞损伤中的保护作用，为进一步研究Sal的神经保护作用提供基础。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂 Sal由成都普思生物科技有限公司提供。30% H2O2购自国药集团化学试剂有限公司；DMEM购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；MTT购自美国Amresco公司；DMSO、RIPA购自北京Solarbio公司；SIRT1抗体和Beclin-1抗体购自美国Santa Cruz公司；LC3抗体购自美国Medical & Biological Lans公司；β-Actin抗体购自北京中山金桥生物有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞处理 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中国医学科学院基础所。细胞培养在DMEM完全培养基（含10% FBS）中，每2～3天换液1次。本研究分为对照组、H2O2组和Sal组。H2O2组：加入H2O2溶液100 μmol/L处理12 h。Sal组：分别加入不同浓度Sal（50、10 μmol/L）处理4 h后，再加入H2O2溶液100 μmol/L处理12 h。对照组加入0.1% DMSO培养12 h。
1.2.2 细胞增殖活性测定 取对数期生长的SH-SY5Y细胞，各组按照1×106个/mL接种于96孔板内，每组设3个复孔。接种24 h后，分别加入各组的处理因素，培养12 h后加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加入DMSO150 μL，37 ℃温箱孵育10 min后，酶标仪测量各孔在570 nm的光密度值（OD570）。实验重复6次。
1.2.3 Western blotting检测蛋白表达 各组细胞处理结束后，PBS洗2次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解细胞，离心后收集细胞上清。BSA蛋白定量测定各组样品中蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，加入等量蛋白样品（30 μg/lane）电泳，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h后，一抗孵育：SIRT1、LC3、Beclin-1（1∶1 000稀释），4 ℃过夜。TBST缓冲溶液洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000稀释）室温孵育1 h后，TBST缓冲溶液洗3次，化学发光液显影成像。用Quantity-One软件分析结果。
1.3 统计学处理 使用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组SH-SY5Y细胞增殖活力比较 H2O2组细胞增殖活力为（70.15±5.21）%，较对照组100%显著下降，比较差异有统计学意义（P<0.001）；Sal组不同浓度（50、10 μmol/L）干预后的细胞增殖活力为（89.35±6.60）%和（81.90±5.17）%，均高于H2O2组（P=0.001、0.017），且随着Sal浓度增加，细胞增殖活力增强。见图1。
2.2 各组SH-SY5Y细胞中SIRT1蛋白表达的比较 利用Western blot检测结果显示，与对照组100%相比，H2O2组SIRT1蛋白含量（65.58±5.34）%明显降低（P<0.001），Sal组不同浓度（50、10 μmol/L）作用12 h后SIRT1蛋白含量为（80.10±5.56）%、（74.98±6.28）%，均明显高于H2O2組（P=0.001、0.014）。见图2。
2.3 各组SH-SY5Y细胞中自噬标志蛋白LC3和Beclin-1表达比较 Western blot结果显示，H2O2组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达分别为（189.20±11.27）%、（160.02±12.15）%，均高于对照组100%，比较差异均有统计学意义（P<0.001）。Sal组（50 μmol/L）的Beclin-1的蛋白表达为（136.86±10.12）%，低于H2O2组（P=0.003），Sal组不同浓度（50、10 μmol/L）LC3-Ⅱ蛋白表达分别为（113.52±10.10）%、（140.68±13.54）%，均可明显降低H2O2引起的LC3-Ⅱ蛋白表达（P=0.002、0.015）。见图3。
3 讨论
氧化應激是导致多种神经性疾病细胞损伤的主要原因[8-11]，因此，清除过度ROS或抑制ROS生成可能有效地防止氧化应激诱导的细胞死亡。Sal是从中药五味子中提取的抗氧化活性物质，研究发现，Sal对脑细胞和动脉内皮细胞具有明显神经保护作用[1-3]，并能显著提高痴呆小鼠的学习记忆能力[12]。自噬称为Ⅱ型程序性细胞死亡，对维持细胞稳态有重要作用[13]。然而过度的自噬可能导致细胞死亡。本研究以SH-SY5Y为研究对象，建立H2O2损伤的氧化应激模型，观察Sal对神经细胞损伤的保护作用及机制。本研究结果显示，H2O2作用SH-SY5Y细胞12 h后，细胞增殖活力较对照组显著下降（P<0.05）；Sal干预后能显著抑制H2O2诱导的细胞增殖活力下降（P<0.05），且随着Sal浓度增加，细胞增殖活力增强。说明Sal具有细胞保护作用。SIRT1是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，可促进赖氨酸残基的乙酰基的裂解，参与衰老、能量代谢、压力反应等多个生理过程。Western blot实验结果显示，H2O2组SIRT1蛋白含量较对照组明显降低（P<0.05），Sal组SIRT1蛋白含量均明显高于H2O2组，提示Sal作用SH-SY5Y后能够显著提高SIRT1蛋白的表达。而Sal通过提高SIRT1蛋白含量，促进抗氧化酶的转录，提高细胞抗氧化能力，减轻H2O2对SH-SY5Y的氧化损伤。
Beclin-1和LC3作为自噬相关蛋白，可在一定程度上反映自噬表达与强烈程度[14-15]。LC3自噬蛋白定位于前自噬泡和自噬膜表面，参与自噬体的形成，是检测自噬活性的一个标志性蛋白[16-17]。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分，在未发生自噬时，细胞内合成的LC3经过加工，形成胞浆可溶性的LC3-Ⅰ而进行常规表达。当自噬发生时，LC3-Ⅰ经泛素样加工修饰过程形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ结合到胞内自噬体的膜上，其含量的多少与自噬泡数量的多少成正比，因此LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达强度与自噬活性密切相关。本研究中LC3在对照组中低表达，主要以LC3-Ⅰ的形式存在。H2O2组LC3-Ⅱ蛋白含量明显高于对照组（P<0.05），且主要以LC3-Ⅱ形式存在，表明H2O2诱导了自噬蛋白的产生，这与文献[18-19]报道一致。Sal干预后，自噬蛋白LC3-Ⅱ表达明显下降（P<0.05）。Beclin-1是自噬体形成过程中的一个重要分子，其能够介导吞噬泡的形成与自噬蛋白定位，从而调控哺乳动物自噬体的形成与成熟。在自噬发生过程中Beclin-1的表达水平随之上升，Beclin-1的表达与自噬体的数量有密切的关系[20]。本研究结果显示，H2O2组Beclin-1蛋白表达明显高于对照组（P<0.05），与LC3表达一致，说明H2O2处理后诱发SH-SY5Y出现自噬。过高水平的自噬可使细胞内容物被溶酶体大量降解，会导致自噬性细胞死亡，Sal组（50 μmol/L）的Beclin-1的蛋白表达低于H2O2组（P<0.05），提示Sal降低LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的水平，抑制H2O2引起的过度自噬，提高细胞的增殖活力。
综上所述，Sal可通过上调SIRT1蛋白表达，拮抗H2O2引起的过度自噬，从而起到拮抗H2O2对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用。
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（收稿日期：2017-12-07） （本文编辑：董悦）