蛇葡萄素F对脂多糖致炎模型细胞的抗炎作用及其机制研究
摘 要 目的：研究蛇葡萄素F（AMPF）对脂多糖（LPS）致炎模型细胞的抗炎作用及其机制。方法：以RAW264.7细胞为模型细胞，采用CCK-8法测定不同质量浓度（100、40、20、10、5 μg/mL）的AMPF处理不同时间（24、48、72 h）后的细胞活性。设正常对照组、模型组和AMPF高、中、低剂量组（40、20、10 μg/mL），分别未加药物处理或加入相应质量浓度的AMPF溶液处理后培养24 h[除正常对照组外，其余各组均在培养1 h时加入LPS（1 μg/mL）致炎造模]。测定各组细胞中白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和一氧化氮（NO）的含量，以及环氧合酶2（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表达水平。结果：当培养时间为24 h时，AMPF各质量浓度组（100、40、20、10、5 μg/mL）细胞存活率均高于90%，AMPF未对细胞产生明显毒性。与模型组比较，AMPF高、中、低剂量组细胞中IL-1β的含量和iNOS的蛋白表达水平均显著降低，高剂量组细胞中IL-6、TNF-α、NO的含量均显著降低，高、中剂量组细胞中COX-2的蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），并呈现一定的剂量依赖性。结论：AMPF对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症具有显著的抑制作用，其机制可能与AMPF調控COX-2和iNOS的表达，进而抑制NO的释放，降低IL-1β、IL-6和TNF-α的含量有关。
关键词 蛇葡萄素F；RAW264.7细胞；脂多糖；炎症；炎症因子
中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）14-1927-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.13
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effect of ampelopsin F （AMPF） on lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory model cells and its mechanism. METHODS： Using RAW264.7 cell as model cell， CCK-8 assay was used to determine the activity of cell after treated for different duration （24， 48， 72 h） with different concentration （100， 40， 20， 10， 5 μg/mL） of AMPF. Then the cells were divided into control group， model group and AMPF high-dose， medium-dose and low-dose groups （40， 20， 10 μg/mL）. They were cultured without or with relevant AMPF solution for 24 h [Except for normal control group， other groups received LPS （1 μg/mL） to induce inflammatory model after cultured for 1 h]. The contents of IL-1β， IL-6， TNF-α and NO， the protein expression of COX-2 and iNOS were detected in cell culture supernatant. RESULTS： After cultured for 24 h， survival rates of cells in AMPF groups （100， 40， 20， 10， 5 μg/mL） were all higher than 90%， showing no obvious cytotoxicity of AMPF. Compared with model group， the content of IL-1β and the protein expression of iNOS were decreased significantly in AMPF high-dose， medium-dose and low-dose groups； the contents of IL-6， TNF-α and NO were decreased significantly in AMPF high-dose group； the protein expression of COX-2 were decreased significantly in AMPF high-dose and medium-dose groups， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）， in dose-dependent manner. CONCLUSIONS： AMPF shows significant anti-inflammatory effect on LPS-induced RAW264.7 cell inflammation， the mechanism of which may be associated with regulating the expression of COX-2 and iNOS， inhibiting the release of NO and decreasing the contents of IL-1β， IL-6， TNF-α and NO.
KEYWORDS Ampelopsin F； RAW264.7 cells； Lipopolysaccharide； Inflammation； Inflammatory factor
金刚藤又名菝葜，为百合科植物菝葜（Smilax china L.）的根茎，具有祛风、活血、解表、收敛止血等功效[1]；其相关制剂用于慢性盆腔炎的临床治疗效果也得到了证实[2]。本课题组前期研究发现，金刚藤总黄酮提取物对慢性盆腔炎模型大鼠具有良好的药效[3-4]。Jin Q等[5]从金刚藤总黄酮提取物中分离出多个单体成分，蛇葡萄素F（Ampelopsin F，AMPF）作为其中具有抗慢性盆腔炎作用的单体化合物之一，已被证实具有抗氧化活性。但关于AMPF的药理药效学等方面的研究报道甚少。小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7具有免疫调节作用，常作为免疫相关研究的模型细胞系[6]。为探索金刚藤的抗炎药效物质基础，本课题组根据文献[7]方法以RAW264.7细胞构建脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型，考察AMPF的抗炎作用，并通过细胞中炎症蛋白环氧合酶2（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS）的表达变化探索AMPF的抗炎作用机制，以期深入开发传统中药材中的有效抗炎单体。
1 材料
1.1 仪器
Tanon-5200型电化学分析仪（上海天能科技有限公司）；PowerPac系列Bio-Rad电泳仪（美国伯乐公司）；SpectraMax M5型多功能酶标仪（美国 MDS公司）；1285型CO2细胞培养箱（美国Thermo Electron公司）。
1.2 药品与试剂
AMPF标准品（武汉天植生物技术有限公司，批号：CFS201701，纯度：98%）；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（美国Bimake公司）；LPS（美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS）、胰酶、DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；白细胞介素1β（IL-1β，批号：CSB-E08054m）、IL-6（批号：CSB-E04639m）、肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：CSB- E08054m）、酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司；总蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20170112）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：20170211）；其余试剂均为市售分析纯，水为双蒸水。
1.3 细胞
小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院细胞库。
2 方法
2.1 细胞培养
RAW264.7细胞采用含10%FBS的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞隔天进行一次传代。待细胞生长至对数生长期后，经胰酶消化后，加入含10%FBS的DMEM高糖培养基吹打均匀，配制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL，待用。
2.2 AMPF溶液配制
取AMPF标准品5 mg，以500 μL甲醇溶解制成10 mg/mL的母液；取AMPF标准品母液适量，用含10%FBS的DMEM高糖培养基稀释，制成终质量浓度分别为100、40、20、10、5 μg/mL的AMPF溶液，用于后续试验。
2.3 AMPF对细胞活性的影响考察
取“2.1”项下RAW264.7细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μL，设AMPF不同质量浓度组[AMPF终质量浓度分别为100、40、20、10、5、0（空白）μg/mL]，每個质量浓度组设3个复孔，分别加入相应质量浓度的AMPF溶液，于37 ℃、5%CO2条件下分别培养24、48、72 h。弃去上清液，每孔加入CCK-8试剂10 μL、含10%FBS的DMEM高糖培养基90 μL，避光继续培养1 h。采用酶标仪，在450 nm波长处测定各孔的吸光度（OD），计算细胞存活率[细胞存活率（%）=（OD样品-OD空白）/OD空白×100%]。
2.4 AMPF对LPS致炎细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响考察
采用ELISA法测定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。取“2.1”项下RAW264.7细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL，设正常对照组、模型组和AMPF高、中、低剂量组（AMPF终质量浓度分别为40、20、10 μg/mL），正常对照组与模型组未加入药物处理，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h[除正常对照组外，其余各组均在培养1 h时加入LPS溶液（LPS终质量浓度为1 μg/mL）以诱导细胞炎症]。取各组细胞上清液，采用IL-1β、IL-6和TNF-α检测试剂盒，按照说明书步骤操作进行含量测定。
2.5 AMPF对LPS致炎细胞中COX-2和iNOS蛋白表达水平的影响考察
采用Western blot法测定COX-2和iNOS蛋白表达水平。按“2.4”项下方法进行细胞接种、分组、给药、造模、培养。取各组细胞上清液，提取COX-2和iNOS总蛋白，具体操作均按照总蛋白提取试剂盒说明书步骤进行。所得蛋白置于100 ℃水浴5～10 min灭活后，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜，电化学分析仪拍照。通过Image J 1.8.0软件分析蛋白电泳条带的灰度值并与内参（GADPH）灰度值比较，计算得相对灰度值用以表示相关蛋白表达水平。
2.6 AMPF对LPS致炎细胞中NO含量的影响考察
按“2.4”项下方法进行细胞接种、分组、给药、造模、培养。取各组细胞上清液，采用NO检测试剂盒，按照说明书步骤操作进行含量测定。
2.7 统计学方法
采用GraphPad Prism 5.01软件处理试验数据。计量资料以平均值表示，采用单因素方差分析进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组细胞存活率测定结果
细胞活性考察结果显示，当培养时间为24 h时，AMPF各质量浓度组（100、40、20、10、5 μg/mL）细胞存活率均高于90%，表明细胞活性较好。本课题组选择中间3个质量浓度梯度（40、20、10 μg/mL）进行后续试验。
3.2 各组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量测定结果
与正常对照组比较，模型组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，AMPF高、中、低剂量组细胞中IL-1β的含量均显著降低，AMPF高剂量组细胞中IL-6、TNF-α的含量均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量比较见图1。
3.3 各组细胞中COX-2和iNOS的蛋白表达水平测定结果
与正常对照组比较，模型组细胞中COX-2和iNOS的蛋白表达水平均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，AMPF高、中剂量组细胞中COX-2的蛋白表达水平均显著降低，AMPF高、中、低剂量组细胞中iNOS的蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中COX-2和iNOS的蛋白表达电泳图见图2，蛋白表达水平比较见图3。
3.4 各组细胞中NO的含量测定结果
与正常对照组比较，模型组细胞中NO的含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，AMPF高剂量组细胞中NO的含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中NO的含量比较见图4。
4 讨论
炎症是一种伴随多种疾病状态的病理现象，巨噬细胞是机体主要的炎症细胞之一。有研究发现，当巨噬细胞受到外界抗原（如LPS）刺激时，会释放NO、IL-1β和TNF-α等炎症因子，它们可促进炎症反应和组织损伤[8-9]。RAW264.7细胞属于小鼠巨噬细胞系，常被应用于炎症反应的研究。本试验采用不同质量浓度的AMPF（100、40、20、10、5 μg/mL）作用于RAW264.7细胞，以考察AMPF对细胞活性的影响。结果发现，上述不同质量浓度的AMPF作用于细胞24 h后，细胞存活率均高于90%，表明细胞活性较好，AMPF未对细胞产生明显毒性，因此选择40、20、10 μg/mL 3个质量浓度梯度的AMPF进行后续试验。
IL-1β、IL-6和TNF-α是机体早期炎症标志物，由单核-巨噬细胞系统和内皮细胞分泌产生，其主要生物学特性是介导炎症反应[10-11]。本试验采用ELISA法测定LPS致炎细胞经AMPF（40、20、10 μg/mL）处理后培养上清液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，结果显示，AMPF能够抑制细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的释放，并呈现一定的剂量依赖性，其中40、20、10 μg/mL的 AMPF能显著抑制IL-1β的释放，40 μg/mL的AMPF能显著抑制IL-6和TNF-α的释放。
在生理状态下，COX-2在绝大多数组织细胞中不表达，只有在细胞受到各种刺激（包括生长因子和细胞因子、血清、促癌剂、癌基因、NO等）时才诱导性表达[12-13]。NO作为炎症发展过程中的促炎因子，参与多种生理和病理过程：在体内，iNOS主要是在炎症和免疫刺激下表达，进而催化L-精氨酸生成NO，过量的NO则会促进炎症性疾病的发生和发展[14]。本试验分别用不同质量浓度的AMPF处理LPS致炎细胞，結果发现40 μg/mL的AMPF能显著抑制细胞中NO的释放。通过Western Blot法测定各组细胞中COX-2和iNOS的蛋白表达水平，结果显示40、20 μg/mL的AMPF能显著抑制细胞中COX-2的蛋白表达，40、20、10 μg/mL的AMPF能显著抑制iNOS的蛋白表达。本研究结果显示，当细胞受到LPS刺激后，胞内COX-2和iNOS的蛋白表达均显著增强，表明炎症通路被激活；而AMPF能够抑制COX-2和iNOS的蛋白表达，这可能是其抗炎作用的机制之一。
此外有研究发现，LPS作用于Toll样受体后，能激活核因子-κB（NF-κB）信号通路进而激活COX-2/前列腺素E2（PGE2）信号通路，使炎症细胞释放促炎因子和细胞毒性物质，如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、PGE2等[15]。NF-κB是早期核转录因子，对参与免疫反应各阶段的许多分子都具有调控作用。在炎症相关蛋白COX-2和iNOS的上游，是否存在与AMPF抗炎作用密切相关的关键靶点如NF-κB，仍有待进一步研究。
综上所述，AMPF对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症具有显著的抑制作用，其机制可能与AMPF能调控COX-2和iNOS的蛋白表达，进而抑制NO的释放，降低IL-1β、IL-6和TNF-α的含量有关。但其明确的作用机制仍有待后续深入研究证实。
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（收稿日期：2017-11-14 修回日期：2018-05-22）
（編辑：段思怡）