HDAC6在ISO诱导大鼠心肌纤维化中的作用研究
材料
1.1.1动物：SPF级SD♂大鼠，200±20g，[实验动物使用许可证SCXK（皖）2011-002]。
1.1.2药品与试剂：异丙肾上腺素由上海禾丰制药有限公司提供；ELISA试剂盒购自北京北方生物技术研究所；HDAC6一抗美国Abcam公司提供；α-SMA、β-actin购自武汉博士德生物工程有限公司；二抗由中杉金桥生物技术有限公司提供，其余为分析剂。
1.2方法
1.2.1动物分组及模型建立：随机均分为两组，设立模型组和正常组，每组各20只。①模型组：皮下注射ISO溶液（5mg/kg-1·d-1），1次/d，持续不间断注射7 d；②正常组：皮下注射生理盐水溶液（5mg/kg-1·d-1），其他过程同模型组。
1.2.2标本采集及处理：正常组和实验组在标准环境下喂食1w后处死，处死大鼠，腹主动脉采血抗凝备用；剖开胸腔，减去大鼠心脏，称全心重和左心室重量；之后迅速放入10%中性甲醛溶液固定后，常规包埋，切片5张，厚4μm；运用HE、Masson染色方法检测纤维化程度；残存心脏标本均放入冻存管，于液氮罐中保存。
1.2.3心脏质量指数的测定：①末次给药后只饮水24h，称重；②腹腔麻醉后，剖胸取血，备用，取心脏；③洗净、吸干后，称全心重量，剥离左心室，称重，计算心重指数和左心室重指数。
1.2.4 HE和Masson染色以及心肌CVF计算：将切片经烤热后于二甲苯和梯度乙醇溶液中脱蜡至水。更换溶液，再重复上述步骤；苏木精染5min，流水冲洗；1%盐酸乙醇快速分化，流水稍洗，促蓝液返蓝数秒，流水冲洗；然后依次行HE染色和Masson染色。固定切片，光学显微镜下观察、摄片。在每张Masson染色切片中，挑取出3个非血管视野（×400），使用图像扫描软件Image Proplus6.0进行扫描分析；计算CVF（%）：胶原面积/总视野面积×100%。
1.2.5 I型及III型胶原含量的检测：血标本取出后，提取血清；依照ELISA试剂盒操作指南进行：包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应、结果判定。分析并酶标仪测定I型III型胶原的含量，绘制标准曲线，计算胶原蛋白含量
1.2.6 HDAC6和α-SMA蛋白表达测定：①心肌总蛋白的提取：取出0.1g心肌组织块，均浆机充分打散并研磨成均匀糊状，置入离心管中；给予RIPA容液1毫升，放置冰上裂解30min、4℃离心机12000转/min，40min；管中提其上清液，测蛋白浓度，变性后于-80℃冰柜中保存留用；②蛋白质电泳：采用常规凝胶电泳系统；③免疫印迹杂交：200mA恒流电转印1h。PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h，一抗工作液，4℃摇床过夜。洗膜，二抗工作液，37℃孵育1h，洗膜；④显影：将A和B发光液按等体积混合；滴于PVDF膜上，压片，曝光，定影；⑤采用Lab Works 4.5图像获取和分析系统软件测定蛋白条带的积分光密度，以β-肌动蛋白作为参考的成像重复3次。
1.2.7 HDAC6、α-SMA mRNA表达：①RNA提取：用核酸提取剂测定心肌细胞中总核糖核酸，测定其核酸，以吸光值为计量，鉴定RNA的含量；②反转录：以总RNA为模板，严格按照试剂盒说明，合成cDNA；③PCR扩增：以β-肌动蛋白作为内参照。依次由变性-退火-延伸三个基本反应步骤进行实时定量PCR扩增，引物序列如下（见表1）；④电泳及结果测定：制作琼胶糖凝胶；取适量的PCR产物，加上样缓冲液充分混合，10V/cm电泳45～60min，成像系统成像分析，引物序列如下。
1.3统计学处理 以SPSS 16.0完善数据处理，采用（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LVW/BW和HW/BW参数测定 实验组与正常组相比，LVW/BW和HW/BW参数有所提升，差异有显著性（P<0.05）。见表2。
2.2血清中I型、III型胶原的含量影响 模型组I型胶原和III型胶原的含量明显高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05），表明通过皮下注射异丙肾上腺素能够引起大鼠血清中I型胶原和III型胶原的含量的增加。
2.3 HE染色和Masson染色以及心肌CVF计算 检测结果显示：模型组：间质成分增多且排列不整齐，核间距离明显增大，含纤维组织沉积；正常组：细胞形态大小基本大致相同且整齐，核间距大致相等，无纤维化表现，见图1；心肌CVF计算，模型组CVF明显高于正常组，见图2。
图1 模型组与正常组大鼠心肌HE染色及Masson染色×200
A：正常组；B：模型组；1：HE染色；2：Masson染色
图2 模型组与正常组大鼠心肌CVF的比较
注：与正常组相比：*P<0.05
2.4 Western blotting法 与正常组相比，模型组大鼠心肌组织，HDAC 6含量和α-SMA含量相对升高，以此表明模型组中的HDAC6及α-SMA蛋白高表达（见图3）。
图3 HDAC 6和α-SMA蛋白表达变化
注：与正常组相比：*P<0.05，**P<0.01
2.5 qRT-PCR 选用相对定量法对大鼠心肌细胞内的HDAC6基因相对于β-肌动蛋白基因的表达变化进行测定。模型组HDAC6和α-SMA mRNA含量较正常组有着较大的增加，模型组中的HDAC6和α-SMA转录水平要高于对照组（见图4）。
图4 HDAC 6和α-SMA mRNA表达变化
注：与正常组相比：*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
心肌组织由心肌细胞和非心肌细胞组成。心肌细胞最主要组成部分是成纤维细胞。当心肌肥厚发生时，心肌细胞失去分裂的能力，仅表现为增生性生长，心肌成纤维细胞仍具备有丝分裂的能力，呈增生性生长。其在刺激因子作用下表达合成胶原蛋白的能力增加。心脏成纤维细胞能分泌多种活性物质，调节自己生产胶原蛋白和周围的心肌细胞的形态结构和生理功能。
心肌纤维化是细胞外的基质不规则代谢而引起过多的胶原纤维沉积用来代替心脏的损伤，是各种心血管疾病进展到终末期的相同病理表现。研究发现，α-SMA蛋白是心脏成纤维细胞活化中最重要的蛋白[1]。因此，我们决定将其作为一个重要的指标来评估心肌纤维化的严重程度。该实验动物模型的制备是通过ISO完成心肌纤维化。实验结果表明测定的纤维化组I型、III型胶原的含量有所增加。同时，纤维蛋白染色法提示：模型组心肌组织间质呈现纤维化改变。对比文献造模数据表明，该实验造模是成功的，该方法简便易行，可重复。
心肌纤维化是心脏损伤代偿的结果，是多种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理过程[2]。心肌间质的主要组成细胞为成纤维细胞，通常多处于未激活状态。但其在决定纤维化细胞促进因子作用下被激活并大量增生，活化的成纤维细胞表达a-SMA并分化为肌成纤维细胞。故心肌成纤维细胞的基因调控是引起心肌纤维化发生发展的最重要的步骤。心肌成纤维细胞类似成纤维细胞和平滑肌细胞，可以作用表达为α-SMA和收缩蛋白。不同于肌成纤维细胞的是，心肌成纤维细胞的诱导细胞增殖以及细胞外胶原的沉积的作用不是很明显[3]。在心肌组织中，成纤维细胞的病理学改变致使心肌顺应性降低，心室舒张功能不全甚至诱发心衰[4]。而致纤维生长因子调控着胶原的转录与合成[5]。α-SMA是心肌成纤维细胞的活化的重要标志物之一[6]。心肌成纤维细胞具有活跃的增殖和分泌胶原的能力，是细胞外基质沉积增多的主要来源，最终导致心肌纤维化的发生发展。因此，α-SMA是判断心肌纤维化严重程度的代表性的指标。
目前已有很多相关研究证实HDAC6与多种肿瘤方面有着较高表达，通过与α-SMA、泛素化等多种方式参与肿瘤的调控。HDAC6异常结合到特定的启动子区从而抑制正常功能基因的转录可能是恶性肿瘤发生的机制之一。目前为止，癌症的治疗已有着突破性的进展，其中HDAC6抑制剂的应用起到相当重要的作用。多种HDAC6抑制剂治疗肿瘤已进入临床试验阶段。然而HDAC6在这种研究肿瘤的道路中如火如荼，却在心肌纤维化中少有报道。在本文中通过构造大鼠心肌纤维化模型，从而探究出HDAC6在心肌纤维化中是有某种相关性，进而研究HDAC 6在心肌纤维化中的作用。Western blotting法和qRT-PCR技术均提示：与正常组相比，造模组中的HDAC 6和α-SMA转录及翻译水平都有明显的上升。那心肌纤维化中HDAC6和α-SMA是如何调控的呢，α-SMA是否会直接影响心肌纤维化我们不从而知，这也是本实验的不足之处。本实验结果仅提示两者之间是一种关联现象，为之后心肌纤维化的深入研究提供基础。
参考文献：
[1]Tao H，Shi K H，Yang J J，et al.Histone deacetylases in cardiac fibrosis：Current perspectives for therapy[J].Cell Signal，2014，26（3）：521-527.
[3]Zeng Q C，Guo Y，Liu L，et al.Cardiac fibroblast-derived extracellular matrix produced in vitro stimulates growth and metabolism of cultured ventricular cells[J].Int Heart J，2013；54（1）：40-44.
[4]Olmedo I，Munoz C，Guzman N，et al.EPAC expression and function in cardiac fibroblasts and myofibroblasts[J].Toxicol Appl Pharmacol，2013 ，272（2）：414-422.
[5]Engebretsen K V，Lunde I G，Strand M E，et al.Lumican is increased in experimental and clinical heart failure，and its production by cardiac fibroblasts is induced by mechanical and proinflammatory stimuli[J].FEBS J，2013，280（10）：2382-2398.
[6]Purnomo Y，Piccart Y，Coenen T，et al.Oxidative stress and transforming growth factor-β1-induced cardiac fibrosis[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2013，13（2）：165-172.
[7]Tao H，Shi K H，Yang J J，et al.Histone deacetylases in cardiac fibrosis：Current perspectives for therapy[J].Cell Signal，2014，26（3）：521-527.
编辑/金昊天