健康水貂肠道中拟杆菌的分离鉴定及药敏试验
摘 要：从健康水貂肠道粘膜及内容物分离出3株菌株，编号为B1、B2和B3。对所分离菌株进行纯化培养、形态学观察、革兰氏染色及生化试验鉴定。初步鉴定结果表明：B1、B2为脆弱拟杆菌，B3
为多形拟杆菌。药敏试验显示分离到的菌株对头孢拉叮、二甲嘧啶、硫酸红霉素、阿莫西林、硫酸庆大霉素、多粘菌素不敏感，对硫酸链霉素、氧氟沙星、头孢噻肟敏感。本试验为毛皮动物专用微生态制剂的研制奠定了理论基础。
关键词：水貂；拟杆菌；分离鉴定；药敏试验
中图分类号：S858.92 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.01.011
Isolation， Identification and Drug Sensitivity Test of the Bacteroides in Healthy Mink Intestine
WEI Ya-song ， ZOU Ling， WEN Jian-xin
（College of Animal Science and Technology， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong 266109，China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Three bacterial strains were isolated from the healthy mink intestinal mucosa and contents， named respectively as B1， B2 and B3； Purified culture experiments， morphology， Gram stain test and biochemical identification experiment were conducted. Preliminary identification results showed that： B1 and B2 belonged to Bacteroides fragilis， B3 belonged to Bacteroides thetaiotaomicron. Susceptibility test results showed that the isolated strains were not sensitive to cephradine， sulfamethazine， sulfate erythromycin， amoxicillin， gentamicin sulfate， polymyxin and were sensitive to streptomycin sulfate， ofloxacin， cefotaxime. This experiment provided a theoretical basis for further research of dedicated probiotics on mink.
Key words： mink； bacteroides； isolation and identification； drug susceptibility test
肠道微生态平衡的建立是在各种菌群的相互协调作用下，共同达到各个菌群的数量、菌种等相对稳态状态[1]。而一旦外界因素突然的改变和介入，如创伤、免疫抑制治疗及抗感染、环境条件改变等，就会对固有菌群这一复杂体系造成刺激，也就意味着肠道中长时间的动态平衡被打破，固有菌群在数量和比例上发生剧烈的变化，某些致病菌和条件致病菌趁机大量增殖时，动物就会发病。当动物发病时，养殖户就会使用大量的抗生素进行治疗，抗生素无节制的滥用又加剧了肠道正常菌群的紊乱，使病情更加的复杂，难以治疗。这时必须采用一种新型的治疗手段来预防和控制动物疾病的发生，于是微生态制剂就应运而生[2-4]。
微生态制剂是用于提高人类、畜禽宿主或植物寄主健康水平的人工培养菌群及其代谢产物，具有无毒、无副作用、无残留污染、不产生抗性的特点，能有效改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫能力，减少疾病的发生，保持健康、促进生长，维持养殖生态平衡[5-8]。作为微生态制剂的主要菌种之一，拟杆菌在微生态制剂的研究应用中就越来越重要。本试验选择培养基，根据拟杆菌的生理生化特征，采用传统的生化鉴定方法，从水貂的肠道内分离鉴定出拟杆菌，为优化微生态制剂的应用效果做了一定的基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物 健康水貂。
1.1.2 试验仪器 无菌操作台、恒温培养箱、自制厌氧罐、光学显微镜等。
1.1.3 试验试剂 普通培养基、营养肉汤培养基和BDS培养基（购于青岛高科园海博生物技术有限公司）、三糖铁培养基、枸橼酸盐培养基、明胶培养基、半固体培养基、革兰氏染液、糖苷醇发酵管（葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇等）、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、药敏纸片（购于杭州天和微生物试剂有限公司）等。
1.2 试验方法
1.2.1 样品的采集和处理 取健康水貂的肠粘膜样品1 g，分别置于含PBS缓冲液9 mL的三角瓶中，振荡30 min混匀，制成匀浆后，静置15 min，制成10-1的稀释液[9]。取灭菌空平皿做好标记，无菌操作取样品100 μL加入平皿，在平皿内倒入适量温度为45～50 ℃的BDS培养基，使稀释液与琼脂混合均匀后静置至凝固，置于37 ℃温箱厌氧培养48 h。
1.2.2 厌氧试验 挑取单菌落，接种于血琼脂平板，分别置于有氧、无氧和含5%～10% CO2环境中培养48 h，观察结果。
1.2.3 形态学观察 挑取典型的、生长良好的单个菌落，接种于BDS培养基，进行纯培养，厌氧环境下37 ℃温箱中培养48 h。观察细菌的生长情况，菌落形状、大小、色泽等形态。
1.2.4 革兰氏染色 挑取典型的菌落，进行革兰氏染色，镜检。
1.2.5 生化试验 按照常规的试验方法[9-11]，对分离的菌株进行糖醇类发酵试验、吲哚试验、MR试验、VP试验、枸橼酸盐利用试验、淀粉水解试验、三糖铁琼脂试验、接触酶试验、明胶液化试验、运动性试验等生理生化试验。
1.2.6 药敏试验 采用常用的K-B法[10]。每菌种挑取菌落4～5个，接种于肉汤培养基中置于37 ℃温箱中过夜培养。取出菌液，用生理盐水将菌液稀释，使其浊度相当于硫酸钡标准管。无菌棉拭子沾取稀释后的菌液，均匀涂布琼脂表面，盖好平皿，置于室温干燥10 min，平皿表面稍干后，用灭菌棉拭子无菌操作取出含药纸片贴于培养基表面，放于37 ℃温箱中培养18～24 h，取出测量抑菌圈直径，根据《抗微生物药物敏感性实验规范》[11]判断药敏结果。
2 结果与分析
2.1 菌落形态及染色
本试验分离到3株菌株，分别编号为B1、B2和B3。细菌培养及革兰氏染色结果见表1及图1。
2.2 生化试验
生化试验结果见表2。本试验共分离到3株菌株，通过细菌培养、染色镜检以及生化实验，参照 《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]综合判断，初步鉴定为拟杆菌属细菌，其中B1、B2为脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis），B3为多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）。
2.3 药敏实验
微生态制剂在生产上常与抗菌药物合用，但大多微生态制剂的说明书上并没有明确指出与抗菌药物联用时是否会影响其活性。通过药敏实验可以了解到抗菌药物对微生态制剂是否有抑制作用，为畜牧生产的实际应用提供参考。药敏试验结果见表3。
由表3可以看出头孢拉叮、二甲嘧啶、硫酸红霉素、阿莫西林、硫酸庆大霉素、多粘菌素等药物对分离到的菌株没有明显抑菌效果，其他药物全部敏感或部分敏感。
3 讨 论
目前，国内对益生菌的研究主要集中在乳酸菌、酵母菌、芽胞杆菌等[14]兼性好氧菌和好氧菌，而拟杆菌等优势厌氧菌还没有得到完全的开发与利用。由于肠道内多数为厌氧菌，厌氧菌作为微生态制剂菌种具有重要意义。对于拟杆菌的益生作用，近年来国内外很多学者[15-16]分别从不同方面做出了一些研究，作为人体和动物体肠道的优势菌群，拟杆菌属细菌在促进肠道发育等方面有重要作用。
通过试验分离得到的3株菌株，在BDS培养基上菌落乳白色半透明，呈圆形、中间微凸，表面湿润，边缘光滑整齐；经革兰染色镜检为阳性红色杆菌，两端钝圆，单个排列或小群聚集，结果与吴彦彬[17]报道相符，参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]综合判断，初步鉴定为拟杆菌属细菌，其中B1、B2为脆弱拟杆菌，B3为多形拟杆菌。虽然采用划线分离、染色镜检、生化试验等方法来进行细菌分离鉴定，但目前多采用16s rDNA序列分析来提高结果的准确性，该方法是根据细菌16s rDNA的同源性来帮助鉴定细菌的，笔者虽然没有采用这种方法，但是根据以上试验结果得出的结论也能做出判断。
致谢：感谢杨洁同学对本试验工作作出的贡献！
参考文献：
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