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一株耐盐耐氧反硝化菌MCW148的分离鉴定及其脱氮特性

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1.1 菌种富集、分离纯化和培养基组成[4]

称取1 g样品放入装有9 mL无菌水的试管中,80 ℃水浴20 min,充分振荡混匀,取1 mL 到下一个同样的试管中,依次稀释得到各种浓度的菌悬液。分别取10-5~10-7 3个稀释梯度的稀释液0.1 mL涂布于NA平板上,然后倒置于培养箱中37 ℃培养24 h。挑取不同形态的单菌落转接至NA斜面上,37 ℃恒温培养24 h,置于4 ℃冰箱保存备用。所挑取菌落同时在NA培养基平板上划线检验纯度。

菌株分离培养基(NA):牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,琼脂20.0 g,pH 7.2~7.4,蒸馏水1 000 mL。

硝酸盐还原产气培养基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,KNO3 1.0 g,pH 7.2~7.4,蒸馏水1 000 mL。

种子培养基:葡萄糖10.0 g,CaCl2 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,(NH4)2SO4 2.0 g,KCl 0.2 g,乙酸钠 3.32 g,pH 7.2~7.4,蒸馏水1 000 mL。

反硝化基础培养基:KNO3 2.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,KH2PO4 0.5 g,葡萄糖 10.0 g,pH 7.2~7.4,蒸馏水1 000 mL。

1.2 反硝化性能测定

250 mL三角瓶中加入100 mL反硝化性能测定培养液,灭菌后加入1 mL培养至对数期的菌液,置于120 r/min、30 ℃下培养,每3 h取样测定培养基中的NO3--N、NO2--N浓度和细菌生长量(以吸光度OD600 nm表示)。

1.3 菌株的鉴定

菌落形态及生理生化鉴定:30 ℃培养24 h,观察菌落形态;革兰氏染色、碳源利用等生理生化指标测定参照文献[10]的方法进行。

16S rDNA PCR扩增和序列测定:将菌株保存至平板中,送往上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序和分析。

1.4 菌株生长条件及脱氮特性

1.4.1 最适碳源 分别以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠为碳源,贫营养反硝化性能测定培养基中的其他成分不变,灭菌后按照1%的量加培养至对数期的菌液,然后置于120 r/min、30 ℃条件下培养,分别在0、12、24、36、48 h取样测定培养基中的NO3--N、NO2--N浓度,计算其去除率。

1.4.2 最适温度 以葡萄糖为碳源,配制化学需氧量(COD)为200 mg/L、NO3--N质量浓度为10 mg/L的贫营养反硝化性能测定培养基,灭菌后按照1%的量加培养至对数期的菌液,分别置于15、20、25、30、35、40 ℃下,120 r/min连续振荡培养24 h,测定培养液中的NO3--N浓度,计算其去除率。

1.4.3 最适初始pH 培养温度30 ℃,初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,其他试验设计同“1.4.2”。

2 结果与分析

2.1 样品的富集培养及菌种的分离纯化

污泥样经过3次富集培养后得到混合微生物的培养物,它可以在含有200 mg/L NO3--N的合成培养基(FM)中生长,在培养过程中通过测定培养液的OD600 nm和NO3--N的浓度,发现该混合培养液中的NO3--N含量不断减少,而OD600 nm不断上升,说明该混合液培养物具有很强的好氧反硝化能力。

上述混合培養物在对氯苯胺的BTB平板上进行划线分离,挑取单菌落,经过复筛、纯化后得到1株具有高效脱氮功能的耐盐好氧反硝化细菌菌株MCW148。

2.2 MCW148菌株反硝化性能

通过实验室模拟养殖系统废水的水质(表1)分析,把MCW148菌株接种于NO3--N初始浓度为150 mg/L的合成培养基中,30 ℃、120 r/min摇床培养,定时取样测定菌体生长、NO3--N和NO2--N的浓度情况。结果(图1)表明,MCW148能在12 h内将NO3--N浓度从140 mg/L以上降至0.05 mg/L以下,同时,NO2--N的浓度先逐步升高,然后逐步降低至0.05 mg/L以下,说明MCW148菌株具有高效的反硝化脱氮能力。另外,由图1还可知,MCW148菌株的生长同步于NO3--N浓度的降低,且MCW148菌株的生长曲线、NO3--N的代谢曲线中的迟缓期基本都在0~3 h,然后进入对数期(4~15 h),约在24 h达到最高的菌体生长量。

2.3 菌株的鉴定

菌株MCW148在LB培养基平板上培养2 d的菌落为乳白色,圆形,中间凸出,表面光滑湿润,直径在1 mm左右;细胞呈直杆状,1.0 μm×3.0 μm,革兰氏阳性,常以成对或链状排列,单极毛(图2)。接触氧化酶阳性;可利用葡萄糖、柠檬酸钠、阿拉伯糖、木糖等为碳源,但利用葡萄糖效果最好;硝酸盐还原和反硝化阳性。扩增菌株MCW148的16S rRNA部分基因,长度为1 516 bp。序列分析表明该菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的同源性最高,为99%[4,11]。结合菌株的形态和生理生化特征,将菌株MCW148初步鉴定为巨大芽孢杆菌。目前,国内外在好氧反硝化菌领域进行了大量的研究[12-16],但在芽孢杆菌属中,具有耐盐和好氧反硝化能力的细菌却鲜有报道。

2.4 MCW148菌株生长条件及脱氮特性

2.4.1 最适碳源 分别以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠为碳源,贫营养反硝化性能测定培养基中的其他成分不变,接种MCW148菌株,在30 ℃、120 r/min摇床条件下培养2 d,定时取样测定NO3--N浓度。图3的结果表明,菌株MCW148能够利用多种碳源进行脱硝酸盐氮,其中,碳源为葡萄糖时,NO3--N的去除效果最佳,培养12 h去除率便达到了62.4%;其次是柠檬酸钠,NO3--N在培养12 h时去除率为34.2%,24 h去除率达到了59.7%;丁二酸钠、草酸钠24 h的NO3--N去除率分别为45.8%和33.7%;而菌株MCW148基本不利用乙酸钠为碳源。因此,葡萄糖为菌株MCW148的最适碳源。

2.4.2 最适温度 由图4可知,MCW148菌体生长和反硝化的温度适宜范围为30~40 ℃,在35 ℃时NO3--N去除率最高,为74%。另外,由图4可以看出,MCW148的生长和反硝化存在一个临界温度,即25 ℃,一旦低于这个温度,MCW148的生长和代谢活性显著降低,因此,该菌嗜高温而对低温非常敏感,建议35 ℃为其最适生长温度。

2.4.3 最适初始pH 由图5可知,MCW148菌株在pH 5~9的范围内对NO3--N的代谢去除活性均较高,其最佳pH为6,此时的NO3--N去除率为60%。

3 小结

本研究从渤海某海水养殖场(北美白对虾)底泥中分离到1株耐盐高效好氧反硝化细菌,经过对其形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析,初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株在去除NO3--N的同时,也能降解COD。菌株MCW148在不同种类碳源下去除NO3--N的能力由大到小依次为葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠、草酸钠、乙酸钠。其生长和代谢NO3--N的最佳条件是温度35 ℃、pH 6,在此条件下,盐度为3%时,菌株MCW148能达到最佳生长状况和最大去除率,12 h对NO3--N的去除率为62.4%。

菌株MCW148具有生长速度较快、对NO3--N去除率高的特点,今后,将对该菌株的代谢机理、酶的影响等方面做进一步的探讨和研究,并结合其他脱氮微生物以及固定化技术,可为海水水产养殖水质改良等方面提供技术支持。

参考文献:

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