达托霉素菌种16SrRNA基因序列分析和遗传稳定性检验

材料

3.1.1 菌种

由江苏恒瑞医药股份有限公司提供的样品MS-1，原辅料达托霉素种子批。

3.1.2 主要培养基、试剂及缓冲液配置

2升LB培养基的配制：分别称取氯化钠（AR）20.0克，胰化蛋白胨（CP）20.0克，酵母抽提物（CP）10.0克于2升洁净干燥的刻度烧杯中，加入约1.8升蒸馏水，用玻璃棒搅拌至溶解均匀，再用蒸馏水定容至2.0 升。

磷酸盐母液配方：340mmol/L KH2PO4/1.44 mol/L K2HPO4的溶液4.62g的磷酸二氢钾和25.08g磷酸氢二钾（32.86g K2HPO4.3H2O）溶在足量的水中，使终体积为100ml。

Platinum R TaqDNA聚合酶、缓冲液体系、定制引物均由LifeTechnologiesTM提供;TA克隆使用的是TAKARA的pMDTM18-TVectorCloningKit;基因组DNA提取试剂盒，凝胶回收试剂盒，质粒小抽试剂盒均由上海硕美生物提供。

3.1.3 培养基分装灭菌处理

将配好的培养基溶液分装于专用试剂瓶内，盖紧瓶盖后再将瓶盖拧松一圈（防止高压下瓶子爆裂），并在瓶盖外包上铝箔纸。同批培养基若有不同种类，标注特别标识。

把装有培养基的试剂瓶放入灭菌锅内灭菌，设定灭菌温度为121摄氏度、时间为20分钟、压力控制在0.1-0.15MPa。灭菌完毕后，从灭菌锅中取出试剂瓶，将其冷却至室温（不烫手便可）后，将瓶盖拧紧，放入冰箱中冷藏备用。

3.1.4 培养基加入抗生素處理

实验前，分别在上述已经冷却的培养基中加入一定体积的AMP/KAN储备液，配成AMP/KAN抗生素培养基。

其它抗生素培养基在实验过程中加入，在无抗性的培养基中加入一定体积的储备液，具体添加储备液浓度、加药量、加水量、加乙醇量、培养基中储备液加入量如下表所示。

储备液的配制溶剂为乙醇（AR）或去离子水，自行保存管理，放置于冰箱冷冻室进行保存，保存期限为六个月。

3.1.5 实验仪器

采用ABI9700型PCR仪进行PCR扩增，使用ABI3730XL型DNA测序仪进行测序。

3.2 16SrRNA基因序列分析试验方法

3.2.1 试验步骤

按照以下的方法步骤，开展16SrRNA基因序列分析：

第一步 根据目的序列设计并合成16s序列，引物序列如下图;

第二步 按试剂盒说明操作，从提供的菌体中提取出基因组DNA;

第三步 以提取的模板和设计的引物进行PCR反应，2%琼脂糖凝胶电泳检测产物;

第四步 产物直接测序，双向引物测通，同时进行TA克隆;

第五步 TA克隆测序结果出来后与产物结果进行比对，是否一致;

第六步 对测序结果进行Blast，并展示结果。

3.2.2 结果与数据分析

（1）鉴定结果

鉴定结果如图1所示（图a为DL2000标准maker，图b为pcr产物跑胶鉴定结果及与maker的对比），电泳跑胶结果显示片段大小在1500bp左右，与16S rRNA序列理论大小一致。

（2） 样品MS-1测定序列

样品MS-1测定序列如下表所示：

（3）Blast结果

通过NCBI网站进行数据比对， Blast结果如下表所示：

3.3 遗传稳定性检测试验方法

3.3.1 试验步骤

按照以下的方法步骤，开展遗传稳定性检测试验：

第一步 根据目的序列设计并合成特异引物，引物序列如下表;

第二步 按试剂盒说明操作，从提供的菌体中提取出基因组DNA;

第三步以提取的模板和设计的引物进行PCR反应，2%琼脂糖凝胶电泳检测产物;

第四步产物可以直接测序，双向引物测通，同时进行TA克隆;

第五步TA克隆测序结果出来后与产物结果进行比对，是否一致;

第六步对测序结果进行Blast，并展示结果。

3.3.2 结果与数据分析

（1）鉴定结果

鉴定结果如图2所示（图a为DL2000标准maker，图b为pcr产物跑胶鉴定结果及与maker的对比）： 电泳跑胶结果显示片段大小在700bp左右，与分析遗传稳定性的特征序列理论大小一致。

（2）样品MS-1测定序列

样品MS-1测定序列如下表所示：

（3）Blast结果

NCBI网站进行数据比对，结果如下表：

结论：目的条带明显，大小在600-700bp左右，与Streptomyces 菌株同源性最高为99%。

4.结论与讨论

测得16S rRNA序列与Streptomyces 菌株同源性最高为99%，NCBI网站进行数据比对，Streptomycessp同源性达到99.86%。表明江苏恒瑞医药股份有限公司提供的样品MS-1，原辅料达托霉素种子批是能够稳定表达和传代的菌株，可用于医药工业批量生产中。

参考文献：

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