转基因玉米MOＮ863品系特异定量PCR方法的建立

摘要：根据转基因玉米ＭＯＮ８６３外源基因的旁侧序列，设计引物和ＴａｑMａｎ探针，建立了转基因玉米ＭＯＮ８６３品系特异定量ＰＣＲ检测方法，并采用该法检测了１％含量的ＭＯＮ８６３玉米粉末（不确定度为１０％）。结果显示，采用构建的方法获得的标准曲线斜率为－３．６～－３．１，相关系数大于０．９９，扩增效率为１０２．２％，在９０％～１１０％内。样品的定量检测结果１．113％接近已知含量１％（不确定度为１０％），表明建立的转基因玉米ＭＯＮ８６３品系特异定量ＰＣＲ检测方法的灵敏度和准确度高，可以在日常检验中推广应用。

关键词：ＭＯＮ８６３；ｚＳＳⅡｂ；旁侧序列；定量检测

中图分类号：Ｓ５１３；Ｑ５０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5250-04

Establishment of Event-specific Quantitative PCR of Genetically Modified Maize

（Zea mays） Event MON863

ＳＯＮＧ Ｊｕｎａ，ＬＥＩ Ｓｈａｏ－ｒｏｎｇａ，ＬＩＵ Ｙｏｎｇｂ，ＹＩＮ Ｑｕａｎａ，ＷＡＮＧ Ｄｏｎｇａ，ＺＨＡＮＧ Ｆｕ－ｌｉａ，ＬＩＵ Ｗｅｎ－ｊｕａｎａ，ＣＨＡＮＧ Ｌｉ－ｊｕａｎａ

（ａ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ； ｂ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｖｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｉｚｅ（Ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３） ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３． Ｓａｍｐｌｅ（ＣＲＭ） ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １％ ｏｆ Ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３ （ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｗａｓ １０％） ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｌｏｐｅ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ －３．６～－３．１． Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ０．９９； Aｎｄ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ９０％～１１０％（ａｖｅｒａｇｅｄ ａｔ １０２．２％）． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ １．１13％， ｃｌｏｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｕｅ ｃｏｎｔｅｎｔ（１％）． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ＧＭＯ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｖｅｎｔ ＭＯＮ８６３； ｚＳＳⅡｂ； ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＭＯＮ８６３转基因玉米是美国孟山都公司２００３年投放市场的转基因产品，具有防、抗虫害能力。ＭＯＮ８６３玉米品系是通过ＤＮＡ重组技术，表达编码一种从苏云金芽孢杆菌中来的抗鞘翅类昆虫的特异杀虫剂蛋白质Ｃｒｙ３Ｂｂ１的基因，来控制玉米根蠕虫的横行。Ｃｒｙ３Ｂｂ１的基因通过粒子加速转化引入公开可供使用的纯种玉米品系Ａ６３４。已有的研究成果表明，Ｃｒｙ３Ｂｂ１没有与已知蛋白毒素和过敏原有同源序列，该蛋白质不存在潜在的毒性和过敏性［１］。２００１年至２００４年，美国、日本、加拿大、韩国等国先后批准进口用作食用或饲料。２００４年４月，欧盟食品安全局确认ＭＯＮ８６３安全可靠。２００５年８月，欧盟批准将这种转基因玉米用于动物饲料，２００６年１月批准其用于人类食品。

２００１年６月６日，国务院发布了《农业转基因生物安全管理条例》，２００２年１月５日，农业部发布了《农业转基因生物标识管理办法》等３个配套管理办法，明确规定对进入我国流通市场的转基因生物及产品实施标识制度，而对转基因产品的定性或定量检测是贯彻标识制度的重要前提，因此对转基因产品的检测显得十分重要。目前，在我国转基因生物安全检测标准中，只有转基因玉米ＭＯＮ８６３品系及其产品定性ＰＣＲ检测方法［2］，尚无定量检测方法。

实时荧光定量ＰＣＲ技术（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）是一种在ＰＣＲ 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对目的基因进行定量分析的方法［3，４］。该技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、实时性和准确性等特点，已经广泛应用于分子生物学研究领域［５－７］。本研究采用生物信息学方法，根据已经报道的相关序列设计特异引物和Ｔａｑｍａｎ探针，建立了转基因玉米ＭＯＮ８６３品系特异定量ＰＣＲ方法，以期为ＭＯＮ８６３玉米定量检测提供科学依据。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料 以含量为１０％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ rｅｆｅｒｅｎｃｅ mａｔｅｒｉａｌ，ＣＲＭ；不确定度为１０％）的ＤＮＡ梯度稀释液作为标准溶液；含量为１％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（ＣＲＭ，不确定度为１０％）作为检测样品（以验证方法的准确性）；含量为１０％和１％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（ＣＲＭ）购自ＩＲMＭ［Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，Ｊｏｉｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ（ＪＲＣ），Ｂｅｌｇｉｕｍ］；作为阴性对照的非转基因玉米为四川省农业科学院基因检测实验室保存的样品。

１．１．２ 仪器 超微量分光光度计（Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００，Ｔｈｅｒｍｏ），高速冷冻离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ），７５００ Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）等。

１．１．３ 试剂 植物基因组ＤＮＡ纯化试剂盒和Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司。

１．２ 方法

１．２．１ ＤＮＡ提取 称取含量为１０％、１％的ＭＯＮ８６３玉米粉末（ＣＲＭ）以及非转基因玉米粉末，各１００ ｍｇ，按照植物基因组ＤＮＡ纯化试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］说明书分离、纯化ＤＮＡ。

１．２．２ 引物与探针 采用ＧＢ１９４９５．４—２００４［８］检测玉米的内标基因ｚＳＳⅡｂ，根据ＭＯＮ８６３旁侧特异片段（来自上海市转基因生物安全性检测评估共享服务平台方法数据库），设计跨越调控元件和玉米基因组的特异引物和探针（表１）。

１．２．３ ＰＣＲ反应体系 将分离纯化得到的含量为１０％的ＭＯＮ８６３玉米ＤＮＡ，按照１∶５稀释成４个浓度梯度：１００．０、２０．０、４．０、０．８ ｎｇ／μＬ。将含量为１％的ＭＯＮ８６３玉米ＤＮＡ稀释成浓度为５０.0 ｎｇ／μＬ。取３ μＬ上述ＤＮＡ稀释液加入到２５ μＬ反应体系：Ｔａｑｍａｎ Ｍａｓｔｅｒ Mｉｘ（２×）１２．５ μＬ，上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，探针（１０ μｍｏｌ／Ｌ）０．５ μＬ，补ddH2O至２５ μＬ。每个ＤＮＡ浓度稀释液做３个平行反应，待检测样品做１５个平行反应，然后在７５００ Real-time PCR system上运行反应程序：５０ ℃，２ ｍｉｎ；９５ ℃，１０ ｍｉｎ；９５ ℃，１５ ｓ；５９ ℃，６０ ｓ（４５个循环）。

２ 结果与分析

２．１ 转基因玉米ＭＯＮ８６３的定量检测标准曲线

该试验通过梯度稀释１０％含量的转基因玉米ＭＯＮ８６３的ＤＮＡ，扩增不同浓度的玉米内标基因ｚＳＳⅡｂ和ＭＯＮ８６３旁侧特异片段，测定其Ｃｔ值。根据Ｃｔ值与ｚＳＳⅡｂ基因含量和ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的不同含量，绘制Ｃｔ值与ｚＳＳⅡｂ基因含量的内标基因标准曲线以及Ｃｔ值与ＭＯＮ８６３旁侧特异片段含量的外源基因标准曲线。由内标基因与外源基因标准曲线测定出样品（１％ ＭＯＮ８６３，ＣＲＭ）的内标基因ｚＳＳⅡｂ和ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的绝对含量，再根据公式“外源基因的绝对含量／内标基因的绝对含量＝外源基因的相对含量”［１０］，计算出样品中ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的相对含量。

用ｚＳＳⅡｂ和ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的引物和探针分别对不同浓度的标准物质ＤＮＡ进行实时荧光定量ＰＣＲ扩增，扩增图谱见图１和图２；获得的Ｃｔ值见表２。试验结果表明，随着ＤＮＡ浓度的降低，其Ｃｔ值相应增大；不同浓度梯度ＤＮＡ稀释液的３个平行反应的Ｃｔ值接近。

平行反应间的Ｃｔ值标准偏差较小，说明该方法检测平行性较好。利用７５００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）自动拟合出Ｃｔ值与玉米内标基因ｚＳＳⅡｂ含量，Ｃｔ值与ＭＯＮ８６３旁侧特异片段含量的标准曲线（图３和图４）。Ｃｔ值与玉米内标基因ｚＳＳⅡｂ的回归方程为■＝－３．２６２ｘ＋３１．５０７，相关系数为ｒ＝０．９９７，扩增效率较高，为１０２．６％。Ｃｔ值与ＭＯＮ８６３旁侧特异片段含量的回归方程为■＝－３．２７１ｘ＋３２．１３３，相关系数为ｒ＝０．９９８，扩增效率为１０２．２％。该试验中的内标基因与外源基因扩增效率较高，说明设计的引物和探针较好，能够满足检测需要。

２．２ 待检样品（１％转基因玉米ＭＯＮ８６３，ＣＲＭ）的定量结果

该试验中待检样品共做１５个平行反应，结果见表３。将获得的待检样品Ｃｔ值代入内标基因和旁侧片段标准曲线的回归方程，得到待检样品的内标基因ｚＳＳⅡｂ和旁侧特异片段的绝对含量（表３）。再根据公式“外源基因的绝对含量／内标基因的绝对含量＝外源基因的相对含量”［１０］，计算出ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的１５次测量结果为１．０32％～１．２44％，平均相对含量为１．１13％，接近已知含量１％（不确定度为１０％），测量值与已知含量的相对偏差为１1．3％，小于基因检验普遍接受的相对偏差（２５％）。

３ 讨论

基因的实时定量ＰＣＲ检测是对转基因产品标识的重要技术手段。本研究以含量为１０％的转基因玉米ＭＯＮ８６３（ＣＲＭ）作为标准物质，分别设计了扩增ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的引物和探针，建立了转基因玉米ＭＯＮ８６３品系特异的实时定量ＰＣＲ检测方法。

实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ fluorescent quantitative ＰＣＲ）技术，是目前得到广泛认可的基因定量检测技术，在实时荧光定量ＰＣＲ中，使用频率最高的是ＴａｑMａｎ探针法。相比ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料法，探针法具有检测结果可靠、准确性高等特点［１１－１３］，而ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料法往往在设计引物时需要克服引物二聚体的生成，否者定量结果不准确。在探针法的实时荧光定量ＰＣＲ中，探针的设计是决定ＰＣＲ扩增效率高低的主要因素。探针含有的碱基数越少，扩增效率就越高，但是较短的探针，其Ｔｍ值也较小。现在很多研究采用ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）探针法，该法能够解决较短探针的问题，同时通过探针结合的ＭＧＢ多肽提高Ｔｍ值。

若ＰＣＲ扩增效率达到１００％的理想状态时，标准曲线的斜率应该在－３．３２，然而在实际操作中，由于抑制物、探针的设计等原因，ＰＣＲ的扩增效率往往达不到１００％的扩增。在实际操作中，ＰＣＲ的扩增效率在９０％~１１０％内，能够获得可靠的结果，而对应的标准曲线斜率的平均值为－３．６～－３．１。Ｒ／ｒ是反映标准曲线相关性的重要参数，在基因的定量检测中，一般要求相关系数Ｒ／ｒ大于或等于０．９９。该试验建立的转基因玉米ＭＯＮ８６３旁侧特异片段的定量ＰＣＲ检测方法，拟合的标准曲线回归方程为■＝

－３．271ｘ＋３2．133，相关系数为ｒ＝０．９９８，由斜率计算出的扩增效率为１０2．2％，在９０％～１１０％内，斜率为

－３．６～－３．１，相关系数大于０．９９，待检样品的定量检测结果１．113％接近真实值１％（不确定度为１０％），结果证明该试验建立的转基因玉米ＭＯＮ８６３品系特异的定量ＰＣＲ检测方法的灵敏度和准确度较高，值得在玉米转基因成分的日常检验中推广和应用。

参考文献：

［１］ 刘 刚． 欧盟重申ＭＯＮ８６３转基因玉米无害［Ｊ］． 农药市场信息，２００７（１６）：２５．

［２］ 农业部８６９号公告－１０－２００７． 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米ＭＯＮ８６３及其衍生品种定性ＰＣＲ方法［Ｍ］． 北京：中国农业出版社，２００７．

［３］ 潘良文，田风华，张舒亚． 转基因抗草丁膦油菜籽中Ｂａｒｎａｓｅ基因的实时荧光定量ＰＣＲ检测［Ｊ］．中国油料作物学报，２００６，２８（２）：１９４－１９８．

［4］ 程晓艳，刘庆慧，黄 倢．实时荧光定量ＰＣＲ检测对虾白斑综合症病毒方法的建立［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０，３８（２６）：１４２６５－１４２６７．

［5］ 欧阳松应，杨 冬，欧阳红生，等． 实时荧光定量ＰＣＲ技术及其应用［Ｊ］． 生命的化学，２００４，２４（１）：７４－７６．

［6］ ＷＥＮＧ Ｈ Ｂ，ＹＡＮＧ Ｌ Ｔ，ＬＩＵ Ｚ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ，ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ－ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉ／Ｙ，ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃａｎｏｌａｓ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ，２００５，８８（２）：５７７－５８４．

［7］ ＨＯＬＣＫ Ａ，ＶＡ Ｍ． ５′－Ｎｕｃｌｅａｓｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｏｎ８１０ ＭａｉｓＧａｒｄ ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，２１４（5）：４４９－４５３．

［8］ ＧＢ１９４９５．４－２００４，转基因产品检测核酸定性ＰＣＲ检测方法［Ｓ］．

［9］ ＧＢ１９４９５．５－２００４，转基因产品检测核酸定量ＰＣＲ检测方法［Ｓ］．

［10］ ＤＥＳＪＡＲＤＩＮ Ｌ Ｅ，ＣＨＥＮ Ｙ，ＰＥＲＫＩＮＳ Ｍ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＢＩ ７７００ ｓｙｓｔｅｍ （ＴａｑＭａｎ） ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳ６１１０ ＤＮＡ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［Ｊ］． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３６（7）：１９６４－１９６８．

［１1］ ＨＥＩＤ Ｃ Ａ，ＳＴＥＶＥＮＳ Ｊ，ＬＩＶＡＫ Ｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１９９６（６）：９８６－９９４．

［１2］ ＶＡＩＴＩＬＩＮＧＯＭ Ｍ，ＰＩＪＮＥＮＢＵＲＧ Ｈ，ＧＥＮＤＲＥ Ｆ，ｅｔ ａｌ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｘｉｍｉｚｅｒ ｍａｉｚｅ ａｎｄ ｒｏｕｎｄｕｐ ｒｅａｄｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｉｎ ｓｏｍｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｆｏｏｄｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４７（12）：５２６１－５２６６．

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