本溪市100例糖尿病患者血清1，,5脱水葡萄糖醇全酶的测定
【摘要】 目的 建立一种测定血清中1， 5-脱水葡萄糖醇（1， 5-AG）的方法， 辅助诊断糖尿病。方法 糖尿病患者（糖尿病组）与健康体检人员（健康对照组）各100例， 采用葡萄糖激酶去除血清样品内源葡萄糖干扰， 过氧化氢（H2O2）在4-氨基替比林（4-AAP）、过氧化物酶（POD）的存在下， 可生成红色醌亚胺化合物， 发生显色反应进行比色测定。结果 该方法最低检测限为1.98 μmol/L， 1， 5-脱水葡萄糖醇在663 μmol/L以内线性良好。测定100例糖尿病组患者血清1， 5-脱水葡萄糖醇含量为（30.7±16.4）μmol/L， 显著低于健康对照组的（170.6±48.2）μmol/L， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 该法简便快速、灵敏、准确和稳定、特异， 可用于糖尿病的及时诊断与监控， 适合于各类实验室常规应用。
【关键词】 葡糖激酶；糖尿病；1， 5-脱水葡萄糖醇
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.33.045
Determination of serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme in 100 diabetes mellitus patients in Benxi city WU Jie-ping. Benxi City Sixth People’s Hospital， Benxi 117002， China
【Abstract】 Objective To establish determination method for serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme （1， 5-AG） to assist diagnosis of diabetes mellitus. Methods There were diabetes mellitus patients （diabetes mellitus group） and healthy people （healthy control group）， with 100 cases in each group. Glucokinase was applied to eliminate interference by glucose in serum samples. Chromogenic reaction of by hydrogen peroxide （H2O2） generating red quinone-imine compound in 4-amino-antipyrine （4-AAP） and peroxidase （POD） were used in colorimetric determination. Results The lowest detectable limit of this method was 1.98 μmol/L， and 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme showed good linearity within 663 μmol/L. Serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme content was （30.7±16.4） μmol/L in 100 diabetes mellitus patients， which were obviously lower than （170.6±48.2） μmol/L in the control group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion As an easy， convenient， sensible， accurate， stable and specific method， it can be applied in timely diagnosis and monitoring of diabetes mellitus. This method is suitable for laboratory conventional application.
【Key words】 Glucokinase； Diabetes mellitus； 1， 5-anhydroglucitol
糖尿病是影响人类健康的代谢性疾病， 血清1， 5-脱水葡萄糖醇是一种存在于血液中的多元醇， 其含量在多元醇糖类物质中仅次于葡萄糖。血清1， 5-脱水葡萄糖醇的实验室检查对糖尿病的诊断分型以及疗效监测都有重要意义。本文旨在探讨1， 5-脱水葡萄糖醇在糖尿病中的辅助诊断价值[1]。该检测项目是继糖化血红蛋白之后又一颇具前景的糖尿病监测指标。目前国外研究较多， 有些发达国家列为常规检测项目， 而国内研究甚少。现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 试剂与标准液 检测1， 5-脱水葡萄糖醇的試剂：辣根过氧化物酶（HRP）10 kU， 3-羟基-2、4、6-三碘苯甲酸4.5 mmol。N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液80 kU ； 1， 5脱水葡萄糖醇标准液：4.5 μmol/L ， 1， 5-脱水葡萄糖醇标准液由山东三维公司生产。
1. 2 仪器 贝克曼奥林巴斯型全自动生化分析仪；UV-2600型分光光度计由岛津公司生产。
1. 3 血清标本 糖尿病组100例患者（1型糖尿病患者21例， 2型糖尿病患者79例）， 均符合1985年WHO糖尿病分类及诊断标准， 其中男60例， 女40例， 年龄17～78岁。病程2个月～25年。健康对照组100例， 其中男53例， 女47例。年龄10～70岁， 其中10～29岁38例， 30～49岁32例， 50～70岁
30例。肝功能、肾功能均正常， 空腹血糖（FBG）、果糖胺（FA）， 无既往糖尿病史。
1. 4 方法
1. 4. 1 原理 首先去除葡萄糖的干扰作用：采用葡萄糖激酶处理血清， 经由葡萄糖激酶（GK）和丙酮酸激酶（PK）偶联系统使血清中葡萄糖彻底转化为不与吡喃糖氧化酶（PROD）反应的6-磷酸葡萄糖。然后加检测试剂（见上文）， 其中的被测1， 5-AG氧化成1， 5-脱水果糖和H2O2， 在H2O2在4-AAP、POD的存在下， 可生成红色醌亚胺化合物， 发生显色反应进行比色测定[2]。
1. 4. 2 参数设置 定标液O浓度（蒸馏水）和304.5 μmol/L 1， 5-脱水葡萄糖醇。主波长545 nm， 次波长710 nm， 两点终点法， 温度37℃， 样品量10 μl， （试剂1）200 μl， 反应5 min、（试剂2） 110 μl， 反应6 min， 读取18和30点吸光度（A）。
1. 4. 3 分光光度计手工测试 空白管调零， 波长546 nm。样品和试剂量按比例增减。读取各管A。计算1， 5-AG（μmol/L）浓度=（测定管A/标准管A）×304.5。
1. 4. 4 干扰试验对照方法 ①血糖（BG）测定采用葡萄糖氧化酶法。②糖化血红蛋白（HbA1c）测定采用微柱亲和层析法。③FA测定采用化学比色法。
1. 5 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示，采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2. 1 反应动力曲线 对蒸馏水、标准液及样品的测定结果表明：呈一条靠近横轴的基本平坦曲线， 蒸馏水空白加试剂1和吸光度A无大变化。标准液和样品加入后反应过程相同， 只是加入试剂2后显色急剧增加， 监测至25点时显色达顶点。对标准曲线的零浓度标准（蒸馏水）重复测定20次， 求出平均数， 再加上3 s， 对应于标准曲线的1， 5-AG浓度为最低检测限， 即1.98 μmol/L。与文献报道[3]接近。
2. 2 线性与最低检测限 G10胶联葡聚糖凝胶电泳1份健康人混合血清， （反复测得1， 5脱水葡萄糖醇为1.4 μmol/L）一分为二， 1份内加入1， 5脱水葡萄糖醇标准物， 混匀后反复测定1， 5脱水葡萄糖醇为663 μmol/L。再用另一份混合血清作基样将其稀释成不同浓度（39、77、254、443、663 μmol/L）， 用本法连续作1， 5-AG定标5次， 生化分析仪自动拟合标准曲线， 回归方程（X为浓度， Y为平均吸光度）为Y=（4.72×10-4）X+0.01555， r=0.9996。结果显示在663 μmol/L以内线性符合要求。
2. 3 精密度实验 连续测定20 d。取各种浓度混合血清各1份， 做批内和批间精密度实验。变异系数（CV）≤5%， 实验精密度相关性要求。
2. 4 准确度实验 按回收试验的方法进行操作， 得到平均回收率为99.8%。符合实验准确度相关性要求[4]。
2. 5 特异性 ①糖类干扰试验：取健康人混合血清1份， 再分别加入生理盐水、10 g/L葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇及2.5 g/L麦芽糖溶液0.1 ml， 按本法测得基础管1， 5-AG为223 μmol/L， 其余各管结果依次为237、233、223、228、224、231及240 μmol/L。干扰率≤±5%为允许误差， 上述干扰物浓度不影响本法。②脂类及血红蛋白（Hb）干扰物试验：受检人群血清中甘油三酯（TG）≤5.9 mmol/L， Hb≤3.4 g/L时都不会影响1， 5-AG测定结果。③胆红素（Bil）干扰试验：干扰率为-2.8%， 提示受检人群上述胆红素浓度存不影响1， 5-AG测定。④饮食物的干扰试验： 健康人空腹与餐后2 h1， 5-AG、BG、FA及HbA1c结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示1， 5-AG测定不受即时进食。
2. 6 正常参考值 用本法对100例健康对照组测得1， 5-AG为（170.6±48.2）μmol/L， 呈正态分布。男女比较差异无统计学意义意义（t=0.41， P>0.05）；各年龄段比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
2. 7 糖尿病患者的检测结果 100例糖尿病组患者血清1， 5-AG浓度为（30.7±16.4）μmol/L， 显著低于健康对照组的（170.6±48.2）μmol/L（P<0.05）。若以健康组结果的95%界限
（ x-±1.96 s）为参考范围， 取1， 5-AG下限（76.1 μmol/L）， HbA1c （7.24%）和FA（2.3 mmol/L）的上限及FBG（>6.66 mmol/L）作为诊断糖尿病的临界值， 则对糖尿病诊断的敏感性分别为95.8%（46/48）。与文献报道[5-12]接近。
3 小结
该法简便快速、灵敏、准确和稳定、特异， 可用于糖尿病的及时诊断与监控， 适合于各类实验室常规应用。
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[收稿日期：2016-11-14]