生化实验报告-血清Alb、γ-G测定

　生物化学实验报告

　姓

　名：

　学

　号：

　专业年级：

　组

　别：

　实验室

　第一部分

　一、实验目的

　掌握程度 实验主要目的

　1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法

　2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法

　3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法

　4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法

　5.了解柱层析技术 二、实验原理

　掌握程度 原理 具体内容

　 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分

　清蛋白

　球

　蛋

　白

　A

　   1 1

　 2 2

　 

　 

　 等电点

　4.88

　5.06

　5.06

　 5.12

　 6.85-7.3

　 相对分 6.9

　 20

　 30

　 9-15

　1.6-30 子质量

　含量

　57-6

　 2-5

　 4-9

　6.2-12

　12-20 1.在 pH6.5 溶液中，清蛋白解离而带负实验名称

　血清清蛋白、γ- - 球蛋白的分离纯化与定量

　实验时间

　实验地点

　指导老师

　 组员

　评分

　批改日期

　离纯化各种蛋白质

　 电荷， 同时(1、(2、(-球蛋白也会解离而带负电。

　2.由于清蛋白的等电点，分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。

　3. (-球蛋白的等电点高于 pH6.5 所以解离而带正电荷。

　 掌握程度 相关方法 原理

　粗提原理-盐析法 1.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。

　2. 调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

　脱盐原理-凝胶层析 1. 盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。蛋白质分子大，无机盐分子小。通过凝胶层析即可将大小不同的物质分离开来。

　2. 凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。

　纯化原理-离子交换层析 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

　 纯度鉴定- 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都

　醋酸纤维素薄膜电泳 低于 pH7.4。它们在 pH8.6 的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

　 一、

　材料与方法

　1、实验材料

　 本次实验仪器

　1.层析柱 2. 电泳仪 3. 电泳槽 4. 加样枪、试管、载玻片、盖玻片等 本次实验试剂

　1. 葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25)层析柱 2. 二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱 3. 饱和硫酸铵溶液 4. 各不同浓度的 pH6.5 醋酸铵缓冲溶液 5. 20%磺基水杨酸溶液 6. 1%BaCl2 溶液 7. pH8.6 巴比妥缓冲溶液 8. 氨基黑 10B 染色液、漂洗液

　 2、实验流程

　3、操作步骤：

　粗提 脱盐 纯化 鉴定 盐 析 法进 行 粗分离 葡 聚 糖 凝胶 G-25 层析

　DEAE 纤维素离子交换层析

　醋 酸 纤维 素 薄膜电泳

　4、注意事项 药品 1.所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生 2.葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉! 操作

　1.使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。

　2.上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。

　3.洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。

　4.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查 SO42-的 BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。

　第二部分

　一、实验结果与处理

　1、实验现象 图片 现象说明

　边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，有白色沉淀产生，溶液呈浑浊状。

　离心后分离沉淀和上清液，在沉淀中加入水溶解。

　两个槽都出现白色沉淀分别是收集球蛋白的峰值和清蛋白的峰值前用磺基水杨酸检测蛋白质。

　 上清液过葡聚糖凝胶 G-25层析柱时现象。

　第一排第二排分别是球蛋白和清蛋白过 G 凝胶时用氯化钡检测硫酸根从阳性到阴性的现象。

　电泳前醋酸纤维素薄膜放在电泳槽。

　染色漂洗后的结果：从左到右依次为血清蛋白 1管、血清蛋白 2 管、

　 

　 球蛋白管、血清对照图谱。

　2、讨论与分析

　 结果：从电泳结果来看，血清蛋白 1 管没有出现电泳图谱，我们小组的实验没有成功。

　实验失败及误差分析：

　实验失败原因分析 1.过 DEAE 纤维素层析住后收集时，可能收集到第二管前清蛋白已经全部流出或者剩下的量过少，使得电泳结果看不出图谱； 2.在放置点样后的醋酸纤维素薄膜时，使点样处可能与电泳槽接触，使得样品与电泳槽黏附，影响电泳。

　电泳图谱不明显，实验误差分析 1.过 D 层析柱时收集蛋白质过慢，处于峰值的蛋白质已有部分流出，造成用于电泳的蛋白质浓度较低； 2.过 DEAE-纤维素层析柱，用磺基水杨酸检测蛋白质均迟迟不出现沉淀便在流出 1.5mL 后即开始收集，可能收集过早，蛋白质收集不全； 3.点样时盖玻片占取的蛋白质溶液过少。

　3、思考题 a.硫酸铵盐析一步，为什么是 0.8ml 血清加 0.8ml 饱和硫酸铵? 答：依据的原理：在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。0.8ml 饱和硫酸铵加到 0.8ml 血清中有利于血清蛋白析出。

　b.为什么实验中 DEAE 纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生，可直接用于纯化清蛋白? 答：当用 0.02mol/LNH4Ac，pH6.5 分离γ-球蛋白时，清蛋白及 a、b球蛋白的 pI＜6.5 ，带负电荷γ-球蛋白 pI ＞6.5，带正电荷；此时清蛋白及 a、b 球蛋白被层析柱吸附，γ-球蛋白被洗脱。当用0.06mol/LNH4Ac，pH6.5 时，a、b 球蛋白被洗脱，清蛋白仍被吸附，只有用到 0.3mol/L 的 NH4Ac 时，清蛋白才被洗脱出来。

　c.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度，根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白？判定它们纯度的依据是什么? 答：与血清蛋白电泳图谱对照，并根据各种蛋白质的带点性质、分子质量大小以及他们的浓度判断他们在电泳时的相对速度来确定。判定它们纯度的依据是电泳图谱的宽度以及颜色深浅。

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