基于乙肝病毒基因突变分析的乙肝个体化诊断与应用研究

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乙型肝炎病毒的复制周期可分为两个阶段，第一个阶段为HBV的结合和入侵、核心颗粒入核、基因组脱壳以及形成cccDNA，第二个阶段则为病毒基因的转录与翻译、初级基因组RNA衣壳化、反转录、病毒颗粒的包装和分泌。

Peg-α-干扰素-2a（聚乙二醇化α-干扰素）和Peg-α-干扰素-2b可用于HBV的治疗[4]。其它能够抑制病毒的复制的核苷类逆转录酶抑制剂，包括阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、拉米夫定（LVD）、替比夫定（LDT）以及替诺福韦（TDF），以及氟化的拉米夫定，恩曲他滨（FTC）均可以用于治疗中。其治疗机制为：核苷类似物进入人体后，通过磷酸激酶的作用激化磷酸化，成为三磷酸核苷类似物，达到逆转录酶的活性和抑制病毒的DNA多聚酶的目的，并与核苷竞争性的掺入乙肝病毒的DNA链，来终止HBV DNA的合成和延长，最终抑制病毒的复制来发挥出抗病毒的作用核苷类似物药物能有效抑制病毒的复制但不能消除已有的病毒和cccDNA[5]。耐药所产生的基本理论在药物进入后，长期的压力下引起突变，对没有发生突变的病毒株进行了抑制，而突变的病毒株则逐渐的失控，最终引起病毒学突破的过程[6]。

拉米夫定具有安全、有效、耐受性好的特点，在临床的实验中用于治疗HBV感染，可能够有效的抑制HBV病毒载量，降低肝脏炎症，改善部分实验室指标，不过在随着用药时间的延长会导致具有抗性的乙型肝炎病毒[7]。其抗性有M204V/I/S改单一位置的突变导致，该位点存在于高度保守的聚合酶催化中心YMDD结构域，M204I的变异可直接发现，但同时伴有L180M突变，该位点的伴随性突变，能弥补增强乙肝病毒的复制能力，同时抵抗拉米夫定的抑制作用[8]。阿德福韦酯是乙肝病毒复制的强效抑制剂，只有微弱的HIV复制抑制的效果，因此被FDA批准为只作为治疗HBV感染的药物，其抗性的产生主要在HBV聚合酶的密码子rt181和rt236位置，当阿德福韦在与拉米夫定预先耐药患者与拉米夫定预先耐药的病毒株组合给药时，可同时诱发两种药物抗性，根据有关的细胞培养研究表明，N236T突变和A181V突变不造成对恩替卡韦的交叉耐药性。替诺福韦出能抑制HBV聚合酶外，也可用于治疗HIV感染[9]。研究表明，替诺福韦与拉米夫定联合应用进行治疗，比单独使用替诺福韦抑制HBV DNA复制更加的有效。更多的感染A基因型HBV的患者与非A基因型HBV感染的患者相比，具有更佳的药物应答效果[10]。目前，替诺福韦主要被用于HBV与HIV的共感染治疗中。拉米夫定和替诺福韦同时用药的方案治疗HBV和HIV共感染的患者，不被推荐为一线治疗HBV单一感染的患者使用[11]。

乙肝病毒载量和自然发生的突变株与乙肝病毒导致的慢性肝脏疾病的长期感染密切相关，在早期的研究资料中，发现C基因型的核心启动子区A1762T/G1764A与B基因型相比更加容易发生变异[12]。同时发现C基因型乙肝病毒患者的病毒载量明显高于B基因型患者，在这种高病毒载量的情况下，C基因型患者与其它基因型的患者相比，发生肝硬化的几率明显要高。本次研究也证实了这一说法[13]。各基因型间的慢性乙型肝炎发病机制具有一些差异，B和C基因型对比A和D的基因型当中，乙肝病毒DNA和乙肝核心抗原在细胞内的表达，以及乙肝病毒DNA和乙肝E抗原在细胞外的分泌表达，B和C基因型均高于A和D基因型[14]。细胞内积累的乙肝病毒DNA和抗原的导致较大肝细胞损伤。

经过大量的临床研究，多项研究已经明确S基因区的保守性较高，并且S区基因也是区分基因型的标志性基因区；研究表示，P基因区为耐药基因区，同时还与S区存在一定的交叉区域，可根据S区的保守性进行分析。有研究表示，BCP-P热C/C 基因区是突变的高发区域，这一高发的突变性导致其不具备基因分型的功能，这一区域的突变程度与肝性疾病的发展存在密切的关联。根据以上基因区对乙型肝炎病毒进行综合判断，乙型肝炎病毒的八种基因型均具有相对的保守性，并且还具有一定的分型特征。通过应用生物信息学分析的方法，目前已经初步建立乙型肝炎病毒基因检测的基因测序基础，也进一步为乙型相关性疾病的诊断提供可靠的参考依据。也最终为乙型肝炎病毒的分型以及耐药的研究利空检测路径[15]。通过本次研究也可以看出，通过对乙型肝炎病毒基因突变的诊断，可以对肝脏病变的程度进行区分，研究结果显示，1762/1764位的基因突变与肝脏损伤呈正向相关；1896/1899位的基因突变与HBeAg呈负向相关。本次选取的乙型肝炎病毒感染者的1896/1899位的基因突变率明显低于肝癌患者1896/1899位的基因突变率（51.67%vs90.0%）；而1896/1899位的基因突变比较则发现，肝癌患者的突变率明显低于乙型肝炎病毒感染者（70.0%vs88.33%）。

综上所述，乙肝病毒基因突变分析对于乙肝个体化诊断提供一定的临床依据。

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（收稿日期：2016-01-05）

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