宫颈癌EGFR和VEGF的表达及相关性研究
[摘要] 目的 探讨宫颈癌中EGFR及VEGF的表达与宫颈癌的关系及其相关性。方法 采用免疫组化EnVision法检测80例宫颈癌组织芯片中EGFR和VEGF的表达，分析其与宫颈癌临床病理特征的关系及其间相关性。结果 宫颈癌中的EGFR和VEGF阳性表达率分别为94.8%、79.1%，癌旁组织中的表达率分别为15%、20%。两者在两种组织中的表达有显著差异（P<0.01）。EGFR表达与肿瘤大小、组织类型、病理分级、浸润深度、淋巴结转移、临床分期有关（P<0.05）；VEGF与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期有关（P<0.05）；EGFR和VEGF表达两者之间有显著性相关性（r=0.2548，P<0.05）。结论 EGFR和VEGF高表达与宫颈癌的生长、浸润转移及预后有相关性，两者在宫颈癌的发展中可能存在协同作用。
[关键词] 宫颈癌；EGFR；VEGF；免疫组织化学；组织芯片；靶向治疗
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）02-0068-04
Expression and correlation of EGFR and VEGF in cervical carcinoma
ZHOU Suying1 CHEN Guorong2 FENG Guofei1 PAN Dan1 ZHANG Pinnan1 YANG Xiaomin1 XIA Zuoli1
1.Department of Pathology， the People’s Hospital of Wenzhou City in Zhejiang Province， Wenzhou 325200， China；
2.Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To study the relationship between the expressions of EGFR， VEGF in cervical carcinoma and to observe the correlation between EGFR and VEGF in them. Methods The expressions of EGFR and VEGF were studied by immunohistochemical EnVision in tissue microarray containing 80 cervical carcinoma tissues and the corresponding adjacent tissues. The relationship between EGFR and VEGF expression and the chinicopathological features was analyzed. Results The positive rates of EGFR and VEGF were 94.8% and 79.1% respectively in cervical carcinoma. However they were 15% and 20% respectively in the corresponding adjacent tissues. Expressions of EGFR and VEGF proteins were significantly higher in cervical carcinoma than those in adjacent tissues （P<0.01）. The overexpression of EGFR was found significantly associated with the tumer size，tissue type，differentiation degree， knubbly invasive depth，lymphnode metastasis and clinical stage（P<0.05）. That of VEGF found significantly associated with the tumer size，lymphnode metastasis and clinical stage （P<0.05）. Besides， the overexpression of EGFR was correlated with the overexpression of VEGF （r=0.2548， P<0.05）. Conclusion The overexpression of EGFR and VEGF in cervical carcinoma are closely correlated with the growth， invasion and metastasis， prognosis， and maybe have synergistic effect in development of cervical carcinoma.
[Key words] Cervical carcinoma； Epidermal growth factor receptor（EGFR）； Vascular endothelial growth factor（VEGF）； Immunohistochemistry； Tissue microarray； Targeted therapy
宫颈癌是发生在全球女性中第二大常见的恶性肿瘤[1]，其发病率有逐年上升且发病年轻化的趋势。表皮生长因子受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR）是宫颈癌发生发展的重要因素，它与相应的配体结合后，形成同源二聚体或异源二聚体，使受体的酪氨酸激酶，启动一系列调节细胞各方面功能的下游信号转导通路，包括细胞增殖、凋亡、血管发生、吸附和运动性，在癌组织中，这些通路调节障碍，可致使细胞过度增殖、转移和耐药[2]。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前发现的最重要的促血管生长因子，有促进血管内皮细胞分化、增生、迁移和浸润的作用[3]，在多种肿瘤中VEGF的表达增高，并且其水平的高低与肿瘤的某些生物学行为有密切关系。本文对构建含有80例宫颈癌和癌旁组织标本的组织芯片进行免疫组化EnVision法检测EGFR、VEGF的表达，以探讨宫颈癌发生发展中EGFR、VEGF表达与宫颈癌临床病理特征的关系和相关性，寻找宫颈癌抗肿瘤治疗的靶点。
1资料与方法
1.1临床资料
随机选择温州市人民医院病理科2003～2009年间80例宫颈癌根治术石蜡包埋组织蜡块。包括鳞癌、腺鳞癌、腺癌，患者年龄 31～72岁。切4 μm切片1张，HE染色后，在蜡块上选取癌组织区域，采用手术组织芯片制备仪，制备成阵列分别为6×4，7×4，7×4，3个组织芯片蜡块。另取癌旁组织20例作为对照，宫颈癌病理分级按WHO分级标准。临床分期按FIGO的标准。
1.2方法
组织芯片上免疫组化采用EnVision二步法，DAB显色。鼠单抗EGFR检测试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司。石蜡切片脱蜡，梯度酒精水化，4%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，按各检测物试剂盒说明书进行，苏木素复染，中性树胶封固，镜下观察结果，记录并拍照。以已知阳性片为阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗为阴性对照。2人双盲法观察切片，选取至少5个具有代表性高倍视野（细胞数不少于1000个），对免疫组化结果进行评估。
1.3结果判断
EGFR表达物定位于细胞浆或细胞膜，以膜着色为主，呈棕黄色；VEGF主要定位于细胞浆，呈棕黄色；镜下根据显色强度和阳性细胞百分率，采用半定量积分法判断结果：基本不着色为0分，着色浅为1分，着色适中为2分，着色深为3分，每张切片阳性细胞占≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；两者积分相乘，阴性≤1分，弱阳性2～4分，强阳性为≥5分。
1.4统计学处理
以SPSS统计学软件进行数据处理，EGFR和VEGF在宫颈癌与癌旁组织中阳性表达率的比较及其与临床病理特征各组间的比较采用χ2检验；变量间相关性用Pearson直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EGFR和VEGF在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达
组织芯片经HE染色后发现2例组织点发生脱片、移位，1例定位有误，未见肿瘤细胞，剔除此3例病例组织学观察77例。EGFR阳性信号在宫颈癌组织中主要分布于癌巢中（见图1）。细胞浆或细胞膜着色，着淡黄色、黄色、棕黄色，同一切片中阳性细胞分布不均，染色范围及程度不同，癌旁与间质表达淡于癌巢。在鳞癌中，角化区域淡于非角化区域。鳞癌表达强于腺癌及腺鳞癌。20例癌旁组织中，3例偶见弱阳性表达，表达位于其基底细胞层及上层不典型增生细胞层；77例宫颈癌中，73例表达阳性，4例阴性，阳性率为94.8%，宫颈癌中EGFR的表达显著高于癌旁组织（校正法：χ2=54.998，P<0.01）（见图2）。
VEGF阳性信号在宫颈癌中主要分布与癌巢中（见图1）。细胞浆着色，呈淡黄色、黄色、棕黄色；癌旁中心区强于周边区，癌旁与间质表达呈阴性或灶区弱表达，与癌巢表达对比鲜明。同时癌旁与间质内可见部分组织细胞（吞噬细胞）呈阳性表达。20例癌旁组织中，4例表达阳性；宫颈癌中，61例表达阳性，阳性率为79.1%，宫颈癌中EGFR、VEGF的表达显著高于癌旁组织（χ2=25.1871，P<0.01）（见图2）。
2.2 EGFR及VEGF的表达与宫颈癌临床病理特征及预后的关系
EGFR在不同年龄、肿瘤大小、组织类型、病理分级、浸润深度、临床分期以及有无淋巴结转移各组中的阴性与阳性表达率比较，差异有统计学意义，与肿瘤的大小、浸润深度呈正相关（P<0.05，P< 0.01）；与肿瘤的病理分级、临床分期呈负相关（P<0.05），在鳞癌中显著高于非鳞癌中（P< 0.01），有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者（P<0.05），而与年龄无显著性差异。见表1。
VEGF在肿瘤大小、临床分期及有无淋巴结转移各组中的阳性、阴性表达率比较，差异有统计学意义，与肿瘤的大小呈正相关（P<0.05）；与肿瘤的临床分期呈负相关，有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组（P<0.05，P<0.01）；与年龄、组织类型浸润深度、病理分级无显著性差异。
2.3 EGFR和VEGF表达的相关性
Pearson直线相关分析显示，宫颈癌组织中EGFR和VEGF的表达呈正相关（r=0.2548，P<0.05），见表2。
表2 EGFR和VEGF在宫颈癌中表达的相关性
注：Pearson列联相关系数 r=0.2548
3 讨论
原癌基因cerbB-1（HER-1）的表达产物—EGFR就位于人染色体7p13-7p12上，属I型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，其与配体EGF结合后可促进细胞的增殖分化并加速细胞的恶性转化[4]。近年研究者越来越关注遗传学分子标记与疾病临床预后的关系，这既是在了解该病发展的分子基础以达到准确地进行临床病理学诊断的需要，更是选择有效的分子靶向治疗而使疾病得以及时遏制并最终获得满意疗效和重要依据之一[2]。因此，很有必要研究宫颈癌与肿瘤治疗重要靶标EGFR的关系。
EGFR强阳性表达率在鳞癌中显著高于非鳞癌中，在鳞癌中EGFR在分化差的癌细胞表达强，在分化好的癌细胞表达弱，这提示EGFR与鳞状上皮的增殖和分化有关；在其他临床病理因素中，EGFR的表达与宫颈癌肿瘤的大小、病理分级、浸润深度、临床分期有显著性差异，与肿瘤的大小、浸润深度呈正相关；与肿瘤的病理分级、临床分期呈负相关；有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者；而与年龄无显著性差异，此结果与大多数文献报道一致[5]。本研究提示EGFR是参与宫颈癌浸润、转移分子机制的重要分子，其过度表达与低分化、高增殖、易转移有关，可作为制定宫颈癌淋巴结转移倾向及其预后的一个有效指标。此外，我们发现，在腺癌或腺鳞癌中，EGFR表达阳性率较鳞癌低，这与Fatima Baltazar等[6]研究结果相符。但本组腺癌或腺鳞癌例数较少，其原因有待更多样本量的研究。
血管内皮生长因子（VEGF）是一种内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外能促进内皮细胞的生长，在体内可诱导血管发生[7]。研究表明，VEGF通过VEGFR介导的受体信号转导通路，促进内皮细胞增殖、迁移，阻止内皮细胞凋亡和宫腔网状结构退化，增加血管渗透性，从而促进肿瘤血管生成和肿瘤生长；并且目前以VEGFR信号转导通路为靶点进行肿瘤靶向治疗已在多种肿瘤取得了实质性的疗效[8]。
近年来，穆彦如等[9]、李雯等[10]认为VEGF参与宫颈癌变过程，且与肿瘤分化及临床分期有关。李淼[3]、宋亚辉等[11]学者认为VEGF与宫颈癌有无淋巴结有关，但穆彦如等[9]认为它与肿瘤分化、组织学类型、浸润深度无关。而宋涛等[12]又认为VEGF与组织学类型有关，腺癌的表达率高于鳞癌的表达率，他们的研究结果不甚一致。我们通过对含有80例宫颈癌的组织芯片进行研究，观察有效对象77例，结果显示：VEGF在宫颈癌中的阳性表达率为79.1%，且肿瘤周边区域的VEGF表达水平较中央区域低，这与文献[3]结果相近。结果表明宫颈癌中VEGF呈过表达，并且与肿瘤的大小、临床分期及有无淋巴结转移有关，与年龄病理分级、浸润深度、组织学类型无关。与肿瘤的大小，临床分期有关，与浸润深度无关，这与穆彦如等[9]、李雯等[10]的观点是一致的；与淋巴结转移有关，这与文献[3，11]的报道是吻合的，说明VEGF过表达者，恶性程度较高，易发生盆腔淋巴结转移，提示肿瘤组织中VEGF水平在一定程度上反映肿瘤的局部浸润活性和转移潜能，与肿瘤的转移分期临床及预后密切相关。因此，对VEGF表达较高者，术中要警惕淋巴结转移和癌细胞浸润可能。但本研究不支持与肿瘤分化有关，这与李雯等[10]的观点不同，这尚需进一步探索。此外，我们发现在肿瘤间质中有些组织细胞呈阳性表达，这与VEGF已知的生物学理论相符，VEGF是肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞所分泌的，以旁分泌的形式，刺激肿瘤内皮细胞，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性[9]。
同时，我们分析了EGFR与VEGF在本组宫颈癌中表达的相关关系，结果发现随着EGFR增加，VEGF也不同程度增加，两者的表达呈正相关，提示它们对宫颈癌有正效应作用，有联合表达，它们表达越高，宫颈癌的侵袭转移功能越大，预后越差。以上研究结果支持EGFR已知的生物学理论[13]，它依赖的下游信号转移通路激活，可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和分化，并增加VEGF的表达水平，继而促进新生血管形成、有利于肿瘤侵袭和远处转移。Ciardiello等[14]也发现EGFR能通过刺激肿瘤细胞分泌VEGF来诱导血管生成。二者联合表达预示更高的淋巴结转移率和更具有侵袭性的生物学行为。
EGFR和VEGF有着共同的信号传导途径，他们直接或间接作用于肿瘤细胞，EGFR是有关血管发生的受体，在肿瘤血管形成过程中的表皮细胞中表达[15]。本组研究表明在宫颈癌中二者均过表达，且呈正相关，与宫颈癌的TNM分期及淋巴结转移密切相关，具有协同效应，存在联合表达。联合应用EGFR阻断剂和VEGF抑制剂分子靶向治疗可能带来更多效应。这预示着在宫颈癌中，以EGFR为靶点的靶向治疗与以VEGF为靶点的抗血管生成疗法联合应用的可行性具有理论依据。
综上所述，EGFR是参与宫颈癌浸润、转移分子机制的重要分子，其过度表达与低分化、高增殖、易转移有关；VEGF与宫颈癌的生长、浸润转移、预后有关；它们在宫颈癌的表达呈正相关，且具有协同效应。通过对宫颈癌的活检或根治标本组织进行EGFR和VEGF表达的病理检测，指导临床以两者为靶点联合靶向用药能成为意义深远的治疗宫颈癌的新方法，值得推广。
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（收稿日期：2013-03-19）